对于血清鸡朊蛋白抗血清制备与其在神经系统中分布

摘要：【目的】目前对哺乳动物朊蛋白生理功能、构象转变机制等已有深入探讨，而关于两栖类、禽类朊蛋白的探讨较少。鸡是最早发现具有PRNP基因的鸟类，而至今尚未见鸡朊蛋白功能及表达机制的相关探讨。由此，本探讨拟通过原核表达鸡重组朊蛋白，以其为抗原制备鸡朊蛋白抗血清，运用免疫组化法确定鸡体内神经组织中朊蛋白的定位与分布，为进一步阐明鸡朊蛋白的生理功能提供科学依据。【策略】根据已报道的ChPRNP基因序列，以健康罗曼鸡全血基因组总DNA为材料，运用分子生物学引物设计、PCR扩增、克隆、测序等策略拟分别获得ChPRNP基因核苷酸序列第73～741位、286～741位和520～741位的目的片段，分别构建重组表达质粒pGEX-ChPrP(25～247)、pGEX-ChPrP (96～247)、pGEX-ChPrP(174～247)，转化E.cop BL21（DE3），筛选、鉴定各重组表达菌，优化表达条件并进行各重组表达菌的诱导表达。通过尿素变性复性、GSTtrap柱亲和层析，纯化GST-ChPrP(25～247)融合蛋白，以其为抗原分别免疫新西兰大耳白兔和BABL/c小鼠，制备抗ChPrP(25～247)多克隆抗血清。经Western blot鉴定后，建立基于该抗血清的免疫组化检测法，用于鸡体内各神经组织中的ChPrP分布测定。【结果】（1）以罗曼鸡全血总DNA为模板，用ChPRNP基因特异性引物进行PCR扩增，成功获得大小为685bp、472bp和232bp的DN段，分别与pGEX-4t-1载体连接并转化E.cop BL21（DE3），经阳性克隆筛选及PCR扩增、EcoRⅠ和BamHⅠ双酶切、测序鉴定，成功构建重组表达载体pGEX-ChPrP(25～247)、pGEX-ChPrP(96～247)和pGEX-ChPrP(174～247)，各重组表达质粒均按设计要求分别插入了669bp、456bp、216bp的目的DN段且无移码。（2）将各阳性克隆表达菌GST-ChPrP(25～247)、GST-ChPrP(96～247)和GST-ChPrP(174～247)诱导表达后，SDS-PAGE浅析可见各重组菌裂解产物中分别出现Mr约为50ku、42ku、32ku的表达条带，其大小与预测各GST-ChPrP融合蛋白的Mr相一致，而空载体pGEX-4T-1转化菌中仅出现1条Mr约26ku的GST标签蛋白条带。（3）以重组菌GST-ChPrP(25～247)进行表达条件优化，以1.0mmol/L IPTG在37℃诱导6～8h时表达量最高，目的蛋白的表达量可占细菌总蛋白量的30%～45%。（4）重组菌GST-ChPrP(25～247)表达菌液经菌体收集、包涵体提取、目的蛋白复性和GSTtrap柱亲和层析纯化，目的蛋白逐渐单一，亲和柱层析纯化的目的蛋白纯度可以达到90%以上。（5）通过免疫的兔子与小鼠分别得到抗体效价为1:12800抗血清。（6）Western bloting证实，抗重组融合蛋白GST-ChPrP(25～247)的抗血清，可与鸡脑组织提取物及重组融合蛋白GST-ChPrP(25～247)、 GST-ChPrP(96～247)和GST-ChPrP(174～247)发生免疫反应，尤其在鸡脑组织提取物中检出蛋白分子大小与已报道鸡朊蛋白的分子质量42ku一致，表明各重组GST-ChPrP融合蛋白具有较好的免疫活性。（7）免疫组化法检测，在鸡的脑、脊髓组织中均发现有ChPrP分布，在大脑的外椎体细胞层中有个别星形细胞与椎体细胞均有ChPrP的表达、在脊髓灰质区中神经元轴突中大量表达ChPrP。【结论】（1）鸡重组朊蛋白GST-ChPrP(25～247)、 GST-ChPrP(96～247)和GST-ChPrP(174～247)均具有良好的免疫活性。（2）免疫组化法检测，鸡脑、脊髓组织中均有朊蛋白分布，脊髓灰质神经轴突中朊蛋白表达最高。关键词：鸡论文PRNP基因论文朊蛋白论文原核表达论文抗血清论文免疫组化法论文神经组织论文

摘要3-4

Summary4-8

缩写词英汉对照表8-9

第一章 绪论9-22

1 朊蛋白国内外的探讨近况9-21

1.1 神经退行性病变、环境和金属离子复合物9-11

1.2 朊蛋白在细胞代谢中的作用11-14

1.2.1 PrP~C细胞定位和运输11-12

1.2.2 PrP~C的神经系统性功能12

1.2.3 PrP~C的免疫学功能12-14

1.3 禽类PrP~C与哺乳动物的PrP~C差别14-17

1.4 朊蛋白与铜离子17-20

1.4.1 哺乳动物和禽类朊蛋白与铜离子的配位特点17-19

1.4.2 多肽重复区的Cu~(2+)结合位点19

1.4.3 Cu~(2+)与PrP~C结合具有类似超氧化物歧化酶活性19-20

1.5 有着的不足及展望20-21

2 探讨目的及作用21

3 探讨的内容及策略21-22

3.1 ChPRNP 基因不同长度片段的原核表达21

3.2 鸡朊蛋白抗血清制备及其在神经系统中的分布21-22

第二章 鸡朊蛋白不同长度片段的原核表达22-31

1 材料与策略22-28

1.1 材料22-23

1.1.1 菌株和质粒22

1.1.2 酶和试剂22-23

1.1.3 主要仪器与设备23

1.2 策略23-28

1.2.1 引物设计与合成23-24

1.2.2 鸡血液基因组DNA 提取24

1.2.3 目的DN段的PCR扩增与回收24

1.2.4 pGEX-4T-1质粒DNA和鸡PRNP目的DN段的酶切与回收24-25

1.2.5 重组表达质粒的构建及鉴定25-26

1.2.6 重组菌的诱导表达和条件优化26-27

1.2.7 表达产物的SDS-PAGE 鉴定27-28

2 结果与浅析28-30

2.1 PRNP基因 DNA 目的片段的获得28

2.2 重组 ChPrP 表达载体的鉴定28-29

2.3 重组菌表达产物的 SDS-PAGE 浅析29

2.4 重组菌诱导表达优化条件29-30

3 讨论30-31

第三章 鸡朊蛋白多克隆抗体的制备及其在机体内神经系统中的检测31-43

1 材料与策略31-37

1.1 材料31-33

1.1.1 菌株和质粒31-32

1.1.2 酶和试剂32

1.1.3 实验动物及鸡各组织材料32

1.1.4 主要仪器与设备32-33

1.2 策略33-37

1.2.1 抗原的制备33-34

1.2.2 鸡重组朊蛋白 GST-ChPrP(25～247)抗血清的制备及其鉴定34-36

1.2.3 抗血清中免疫球蛋白 IgG 的分离36

1.2.4 鸡体神经组织中朊蛋白的分布检测36-37

2 结果与浅析37-40

2.1 GST-ChPrP(25～247)目的蛋白纯化37

2.2 抗 ChPrP 抗血清效价的测定37-38

2.3 抗 ChPrP 抗血清的特异性鉴定38-40

2.3.1 抗血清的 Western blotting 检测38-39

2.3.2 抗血清敏感性、特异性的 ELISA 检测39-40

2.4 鸡各个组织中朊蛋白的分布40

3 讨论40-43

结论43-44

致谢44-45