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摘要：聚羟基脂肪酸酯（Polyhydroxyalkanoate, PHA）是一种由许多细菌在营养不平衡条件下合成的胞内能量和碳源贮藏性的物质。PHA有着良好的生物相容性、生物可降解性、憎水性以及由不同官能团带来的独特性质，被用作组织工程材料药物缓释材料，是一种有很好进展潜力的生物材料，是当前倍受关注的第三代生物材料之一，成为当今生物材料领域最为活跃的探讨热点。目前生物合成的PHA还不能满足各领域对于新型生物材料的需求，且有着产率低、成本高、单体组分单一等不足，这吸引了学术界和产业界等探讨人员的极大关注，试图通过各种策略解决这一关键技术不足。PHA合酶是PHA生物合成的关键酶，利用蛋白质工程技术对PHA合酶进行改造以期转变底物特异性、提升催化活性、转变单体组成、获得新型PHA是当前探讨热点。嵌合酶是融合两个或者更多的酶，并且能够显示出两种亲本酶的特性的酶。最近几年，PHA合酶嵌合酶的探讨逐渐成为热点。运用嵌合PHA合酶可以扩展其底物的广泛性，提升PHA产量，以而降低生产成本，使之与化学合成的塑料接近，并开发新的用途，并且能够产生新类型的PHA。在探讨PHA嵌合酶时还发现，PHA合酶N端与酶的性质，例如底物特异性、酶活性、耐热性相关，对于聚合反应，最终聚合物的组分起着重要作用，可以通过对N端的改造来转变PHA合酶的底物特异性，催化活性等特性。在本探讨中，我们以实验室的嗜水气单胞菌、起皱检测单胞菌、恶臭检测单胞菌为出发菌株，分别进行了N端缺失突变探讨，合酶基因的克隆和合酶功能验证。重组菌产生的PHA与野生菌产生的PHA类型、单体组成均有不同。具体探讨结果如下：1）嗜水气单胞菌（Aeromonas hydrophila）WQ株PHA合酶N端缺失突变体构建。设计引物对嗜水气单胞菌PHA合酶进行克隆，同时进行N端第2到28位氨基酸的缺失突变，构建重组质粒，将重组质粒转化大肠杆菌S17-1，以大肠杆菌S17-1介导结合转化，将重组质粒pBBR1MCS2-phaC'JWQ转化到富养产碱菌（Ralstonia eutropha）突变株PHB-4中。选择不同碳源摇瓶发酵验证PHA合酶功能活性，三种不同碳源产生的PHA单体组成不同，以月桂酸为碳源时菌体生长最好，PHA产量最高，占细胞干重的65.05%，以果糖为碳源时只产生了3HB一种单体，而野生型的嗜水气单胞菌产生约占细胞干重25%的PHBHHx，与重组菌产生PHA类型有所区别。2）起皱检测单胞菌（Pseudomonas corrugata）Ⅱ型合酶功能验证。本实验室已构建起皱检测单胞菌pBBR1MCS2-phaC1、pBBR1MCS2-phaC2的表达质粒，根据相关文献，选用果糖、甘油、月桂酸、葡萄糖酸钠、油酸钠等不同碳源验证起皱检测单胞菌pBBR1MCS2-phaC2合酶功能活性，结果表明重组菌可以利用油酸钠为碳源产生了PHA，占细胞干重的1.23%。3)恶臭检测单胞菌（Pseudomona putida）KT2442Ⅱ型合酶的克隆。为了丰富实验室PHA合酶基因库，将来构建Ⅱ型嵌合酶，设计引物对恶臭检测单胞菌Ⅱ型PHA合酶进行克隆，构建重组质粒，将重组质粒转化大肠杆菌BL21中。本探讨对Ⅰ型PHA合酶N端进行了缺失突变探讨，证明了N端对于PHA合酶功能的影响，同时进行了两种Ⅱ型合酶基因的克隆，功能的验证，保证了今后嵌合酶的成功构建，嵌合PHA合酶可以扩展其底物的广泛性，提升PHA产量，降低生产成本，使它的物理化学性质与化学合成的塑料接近，并开发新的用途以产生新类型的PHA，将极大的推动PHA的更为广泛的运用。关键词：聚羟基饱和脂肪酸酯论文PHA论文合酶论文嗜水气单胞菌论文起皱检测单胞菌论文
摘要4-6
Abstract6-12
引言12-18
0.1 聚羟基脂肪酸酯介绍12-14
0.2 PHA 合酶14-17
0.3 探讨目的和作用17-18
第1章 嗜水气单胞菌 PHA 合酶 N 端缺失突变体构建18-37
1.1 实验目的18
1.2 案例设计与浅析18
1.3 实验材料与试剂18-22
1.4 基本实验策略22-28
1.5 结果与讨论28-37
第2章 起皱检测单胞菌Ⅱ型合酶功能验证37-44
2.1 实验目的37
2.2 案例设计与浅析37
2.3 实验材料与试剂37-39
2.4 基本实验策略39-40
2.5 结果与讨论40-44
第3章 恶臭检测单胞菌Ⅱ型合酶克隆44-51
3.1 实验目的44
3.2 实验案例44
3.3 实验材料与试剂44-45
3.4 基本实验策略45-48
3.5 结果与讨论48-51
结论51-52
致谢52-53