摘要：本论文对实验室以浙江沿海水域海水中分离得到的类芽孢杆菌（Paenibacillus sp.）WL菌株进行平板分离纯化，筛选出酶活较高的菌株作为出发菌株。对该菌株进行紫外诱变，筛选到1株产琼胶酶活力为26.7U/mL，较出发菌株提升了12.2%的菌株WL-68。对WL-68进行γ-射线诱变，得到了产琼胶酶酶活力为31.5U/mL，较WL-68提升了25.0%的菌株WL-68-46。对WL-68-46进行N+离子注入诱变，筛选得到1株高产琼胶酶的菌株WL-68-46-15，产琼胶酶活力达到47.3U/mL，较WL-68-46提升了53.6%，较出发菌株提升了108%。将菌株WL-68-46-15标记为WL-15。优化了产酶培养基中作为菌体生长碳源的琼胶、作为氮源的NaNO3和主要盐类NaCl的浓度，得出在琼胶、NaNO3和NaCl的浓度分别为2.5g/L，6.0g/L，15.0g/L时，类芽孢杆菌菌株WL-15的产酶活力达到了53.3U/mL，较优化前酶活提升了17.9%。遗传稳定性试验表明菌株WL-15具有较好的产酶稳定性。将菌株WL-15以斜面培养基接入种子培养基中扩培24h后，再转接至发酵培养基中培养24h。发酵培养结束后将发酵液于4℃、8000r/min下离心20min弃去沉淀，得到的上清液即为粗酶液。粗酶液采取硫酸铵分级沉淀，收集硫酸铵饱和度为20%-80%的沉淀。沉淀溶解在20mmol/L pH7.5的磷酸盐缓冲液中，离心去除不溶的物质，将溶液装入透析袋中于同样的缓冲液中透析2d，浓缩后上样于DEAE-阴离子交换柱。经过预实验确定DEAE-阴离子交换柱层析的平衡液为浓度20mmol/L、pH7.5的磷酸盐缓冲液，洗脱液为含有0～1mol/L NaCl的20mmol/L、pH7.5的磷酸盐缓冲液，流速为1mL/min，收集洗脱液，3mL/管。合并有酶活的组分，浓缩后上样于凝胶层析柱。凝胶层析的洗脱液为20mmol/L、pH7.5的磷酸盐缓冲液，流速为1mL/min，收集洗脱液，2mL/管。合并有酶活的组分，冷冻干燥后得到酶粉。SDS-PAGE结果显示得到的琼胶酶为单一条带，相对分子质量为30kDa。琼胶酶的纯化倍数为11.9倍，酶活回收率为5.1%。对分离纯化得到的琼胶酶进行酶学性质的探讨，探讨了经分离纯化的琼胶酶最佳作用温度和最适作用pH，得出该琼胶酶水解琼脂的最佳作用温度为40℃，最适作用pH值为6。探讨了金属离子、表面活性剂、金属离子螯合剂等对该琼胶酶水解琼胶的酶活的影响。Na~+、K~+、Fe~(2+)、Mg~(2+)、Ba~(2+)、Sr~(2+)、Al~(3+)等金属离子对琼胶酶水解琼脂具有推动作用，Cu~(2+)和Mn~(2+)对其水解琼脂具有较强的抑制作用。表面活性剂SDS、金属离子螯合剂EDTA均对琼胶酶水解琼脂有一定的加强作用。通过探讨该琼胶酶对不同浓度的琼胶底物的水解速度，采取双倒数做图法得到该酶水解的米氏常数Km值、最大水解速度Vm值分别为3.41mg/mL和444.3U/(mL·min)，说明了该琼胶酶对琼脂具有较大的亲和力和较高的作用效率。底物专一性的探讨表明该琼胶酶对琼脂具有很好的底物专一性，同时对卡拉胶有一定的水解作用。关键词：琼胶酶论文诱变育种论文分离纯化论文酶学性质论文
摘要4-6
ABSTRACT6-10
第一章 绪论10-24
1.1 前言10
1.2 琼胶10-13
1.2.1 琼胶的结构11-12
1.2.2 琼胶的运用12-13
1.3 琼胶寡糖13-15
1.3.1 琼胶寡糖的制备13-14
1.3.2 琼胶寡糖的分离和结构浅析14
1.3.3 琼胶寡糖的运用14-15
1.4 琼胶酶15-22
1.4.1 琼胶酶的分类15-16
1.4.3 琼胶酶的作用机制16
1.4.4 琼胶酶的来源16-17
1.4.5 琼胶酶的运用17-18
1.4.6 琼胶酶探讨近况18-22
1.5 本论文探讨的目的、作用及主要探讨内容22-24
第二章 产琼胶酶微生物的诱变育种24-44
2.1 引言24-25
2.2 材料与策略25-31
2.2.1 实验材料25-27
2.2.2 实验策略27-31
2.3 结果与讨论31-42
2.3.1 紫外诱变31-35
2.3.2 γ-射线诱变35-37
2.3.3 N~+离子注入诱变37-40
2.3.4 突变菌株传代稳定性试验40
2.3.5 产酶培养基的优化40-42
2.4 小结42-44
第三章 琼胶酶的分离纯化44-59
3.1 引言44
3.2 材料与策略44-51
3.2.1 实验材料44-46
3.2.2 实验策略46-51
3.3 结果与讨论51-57
3.3.1 硫酸铵沉淀51-52
3.3.2 DEAE-阴离子交换层析52-54
3.3.3 凝胶柱层析54-56
3.3.4 SDS-PAGE56-57
3.4 小结57-59
第四章 琼胶酶的酶学性质探讨59-67
4.1 引言59-60
4.2 材料与策略60-61
4.2.1 实验材料60
4.2.2 实验策略60-61
4.3 结果与讨论61-66
4.3.1 温度对琼胶酶酶活及稳定性影响61-62
4.3.2 pH 对琼胶酶酶活及稳定性影响62-63
4.3.3 不同无机离子对琼胶酶酶活的影响63-64
4.3.4 米氏常数的测定64-65
4.3.5 底物专一性65-66
4.4 小结66-67
结论和展望67-70
1 结论67-68
2 展望68-70
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