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摘要：探讨背景及目的皮肤作为人体最大、最复杂的器官具有多种生理功能,如屏障功能、感觉功能、吸收功能、体温调节功能、分泌排泄功能等,然而,皮肤同时也是最易受创伤损害的器官。烧伤、创伤、肿瘤切除、难治性溃疡等各种理由均可造成皮肤组织缺损,严重影响患者功能和外观,造成患者心理压力及劳动能力和生活质量下降,给患者家庭及社会带来极大的经济负担及社会负担。由此,皮肤组织缺损的修复始终是整形外科面对的首要不足。组织工程化皮肤的进展为皮肤组织缺损的修复提出了新的对策。自以1975年Rheinwald和Green首次在体外成功的大规模培养出表皮细胞,才使得组织工程皮肤替代物的研制逐渐广泛,目前组织工程皮肤替代物依解剖结构可分为表皮替代物、真皮替代物以及表皮/真皮复合皮替代物三种。表皮替代物缺乏真皮的机械支持和营养,创面愈合后上皮瘢痕增生严重,抗感染能力差、易破溃、弹性欠佳、柔软度不足、移植后易脱失,修复效果难以令人满意。真皮替代物虽可减少创面收缩,对创面要求不高,但缺少表皮的防护,使感染机率升高,同时缺少表皮覆盖易造成体内水电解质代谢紊乱,真皮替代物修复后外观欠佳,尤暴露部位显著。表皮/真皮复合皮替代物在化学行为及代谢方面均类似于人正常皮肤,具有良好的机械性能和移植物接受率。在创面愈合历程中,由于间充质-表皮的相互作用,复合皮移植物可缩短真皮机化时间、抑制瘢痕形成,推动皮肤再生,是目前较成熟的双层组织工程皮肤替代物,可达到永久性修复创面的目的。复合皮替代物的代表产品是1998年被美国FDA批准治疗静脉淤滞性溃疡的Appgraf,它是以Ⅰ型牛胶原基质为支架,在牛胶原上先种植新生儿包皮成纤维细胞,经过一段时间后形成“真皮”,再在其上种植新生儿包皮表皮细胞,表皮细胞以单层生长成多层,最后形成含表皮层、真皮层的双层结构复合皮。Appgraf已成功运用于治疗静脉淤滞性溃疡和糖尿病足部溃疡,推动创面愈合。Appgraf不含Langerhans细胞、血管内皮细胞、单核细胞、白血细胞等含抗原的细胞,临床运用证明无排斥反应发生,免疫学检测亦未见对表皮细胞和成纤维细胞产生体液或细胞免疫反应。然而,在临床上广泛运用的皮片移植,其耐磨性、弹性差,易挛缩,易形成水疱及色素沉着等。与皮片移植相比,含有皮下脂肪层的皮瓣移植可克服上面陈述的皮片移植的弱点,保存皮肤的性能和功能。皮瓣移植不但能修复创面,恢复外观且还能兼顾功能修复(尤其关节部位功能修复)。对于颜面,功能部位,有骨、关节、神经干、大血管裸露的创面及慢性溃疡等创面需采取皮瓣移植修复。以皮肤结构方面比较,皮瓣包含皮下脂肪组织层,脂肪组织具有多种生理功能,如调节体温功能、屏障功能、能量储存功能等。另外,皮下脂肪组织作为一种内分泌器官具有多种病理生理作用,如参与体内炎症反应、血管疾病、肥胖等代谢性疾病历程。皮下脂肪及其内的干细胞还可通过分泌多种脂肪细胞因子和干细胞因子调控皮肤中的成纤维细胞和表皮细胞生物学行为以而对创面愈合产生影响。由于皮瓣移植修复皮肤组织缺损的优越性及皮下脂肪组织功能的重要量,组织工程皮肤替代物的进展方向之一就是构建含皮下脂肪组织层的皮肤复合组织。目前,皮肤复合组织探讨还处于初步阶段。Maike等将Matriderm(?)支架置于前脂肪细胞悬液上,而后在支架另一面种植表皮细胞构建含皮下脂肪层的多层皮肤复合组织,以提升深层切痂后创面修复的功能和外观效果。但此法靠前脂肪细胞悬液中的细胞自行进入支架内部,进入支架内的细胞量及程度无法制约,且该法构建的多层皮肤复合组织无“真皮层”,与正常皮肤结构不一致。Trottier等运用脂肪组织来源干细胞的成脂潜能,采取“自组装”方式构建含有表皮层、真皮层及皮下脂肪层三层结构的皮肤复合组织。然而此法程序复杂,不利于操作,仅用脂肪组织来源干细胞一种细胞作为种子细胞,靠刺激细胞分泌的细胞外基质作为支架,与正常皮肤结构有差别较大。国内邹运动采取鼠脂肪组织切片作为皮下脂肪层与构建的复合皮模拟皮肤的三层结构,为构建含皮下脂肪组织层的皮肤复合组织提供了一种模型。构建含皮下脂肪层的皮肤复合组织关键环节是构建组织工程化脂肪。采取以脂肪组织中提取的细胞构建组织工程化脂肪无疑更“经济”。以抽脂物中提取的SVF是一个多细胞群体,含有ASCs、内皮细胞、周细胞等细胞成分,其中分子表面标记为CD31-/CD34+/CD45-/CD90+/CD105-/CD146的一类细胞是ASCs,Zuk等首次证实其具有成脂、成软骨、成骨等干细胞多向分化潜能。ASCs是一种间充质干细胞,在细胞形态和免疫学表型上与骨髓间充质干细胞相似,Emanuele等较全面、系统的比较了ASCs与骨髓基质干细胞(BMCs)的细胞表面特点：CD29、CD44、CD54、CD90、CD105、CD166、STRO-1在ASCs和BMCs表面均阳性表达；CD31、CD34、CD45均阴性表达；CD49在ASCs表面阳性表达而在BMCs表面阴性表达；CD106在ASCs表面阴性表达而在BMCs表面阳性表达。ASCs与BMCs相比具有许多优点：首先,ASCs较BMCs易分离获取且不易造成继发缺损。以整形美容外科患者腹部、上臂、大腿、臀部等部位抽出的脂肪组织均可获取ASCs。其次,抽脂可获得大量脂肪组织,以而获得大量ASCs。再次,人ASCs可自体获取,这样可以避开免疫排斥和道德学方面的不足。此外,人ASCs经多次传代后也和BMCs一样仍然能够保持良好的遗传性状,具有较低的衰老程度。在脂肪组织工程领域,以ASCs作为种子细胞,分别以胎盘去细胞基质、PLGA、胶原海绵、纤维蛋白胶等作为支架,均成功构建出脂肪样组织。本实验拟以表皮细胞、成纤维细胞、脂肪组织来源干细胞作为种子细胞,以Ⅰ型牛胶原凝胶为支架,在体外分别构建出表皮/真皮复合皮和组织工程化脂肪,然后按照正常皮肤组织结构顺序将复合皮与组织工程化脂肪“组装”并继续培养,试构建出含表皮层、真皮层及皮下脂肪层的多层皮肤复合组织,为组织工程构建皮肤复合组织奠定实验基础。探讨策略1.脂肪组织来源干细胞、成纤维细胞、表皮细胞三种细胞的分离培养、鉴定及标记以脂肪组织中分离血管基质片段(SVF),进而获取脂肪组织来源干细胞。对脂肪组织来源干细胞进行成脂、成骨及成软骨定向诱导分化,鉴定其多向分化潜能。以包皮组织中分离成纤维细胞和表皮细胞,Vimentin免疫组化染色鉴定成纤维细胞,DiI标记成纤维细胞。2.表皮细胞、成纤维细胞构建表皮/真皮复合皮成纤维细胞与Ⅰ型胶原凝胶混合构建活性真皮替代物,并进行大体观察、含水量测定、显微观察、荧光显微镜观察、扫描电镜观察、HE染色观察、免疫组化染色观察、体内创面修复实验。另外,在构建活性真皮替代物的基础上构建表皮/真皮复合皮替代物。3.脂肪组织来源干细胞及复合皮构建含皮下脂肪组织的多层皮肤复合组织用脂肪组织来源干细胞构建组织工程化脂肪,然后按正常皮肤结构顺序将培养的复合皮与构建的组织工程化脂肪按正常皮肤结构顺序组装并培养,构建含皮下脂肪组织的多层皮肤复合组织。4.统计学处理采取SPSS13统计软件进行浅析,数据以均数±标准差表示,细胞生长曲线采取回归浅析法,P0.05时为差别有统计学作用。结果1.脂肪组织来源干细胞、成纤维细胞、表皮细胞三种,细胞的分离培养、鉴定及标记脂肪组织经过消化离心后可获得SVF,SVF经过贴壁培养可获得脂肪组织来源干细胞。脂肪组织来源干细胞可诱导向成脂、成骨、成软骨细胞分化。免疫组化Vimentin染色成纤维细胞后见细胞呈长梭形,胞浆呈深棕色,胞核呈蓝色。DiI标记成纤维细胞后,细胞轮廓清晰,发出强烈的红色荧光,胞核不显示荧光。DiI对成纤维细胞成活率无显著影响,标记后细胞最高成活率达97.12%。刚分离的表皮细胞为透亮的小圆形细胞,生长融合后呈铺路石样。2.表皮细胞、成纤维细胞构建含表皮层、真皮层的复合皮刚制备的活性真皮替代物呈粉红色半透明状,随培养时间延长,直径缩小,颜色变浅,厚度变薄,透光性下降,韧性增加,经过初步收缩后在第5-10d基本稳定,至14d时直径为原直径的18.2%,可用镊子提起而不破碎。培养历程中真皮替代物含水量不断降低,在第1d、4d、7d、11d含水量平均分别为69.3%、67.1%、65.5%、64.3%,整个历程中含水量稳定在60%以上。成纤维细胞分布于凝胶中的不同层次,细胞相互交错,连接形成网络状,排列无一定方向。培养2w较1w时细胞显著增加。DiI标记的成纤维细胞在凝胶中仍发出红色荧光,细胞形态清晰,未见细胞死亡,随培养时间延长及细胞增殖,荧光强度无显著衰减。收缩后的真皮替代物表面较疏松而深层较致密。细胞生长在立体网格状空隙内,同时可见到胶原纤维断端回缩形成的结节。随培养时间延长,真皮替代物内胶原纤维排列更加规则且致密,细胞增加并平行胶原纤维排列。成纤维细胞在胶原凝胶中生长良好,保持分泌活性,Ⅰ型胶原蛋白、纤维连接蛋白、血管内皮细胞生长因子均阳性表达。真皮替代物覆盖创面4w后,可见实验组创面收缩及瘢痕形成均较对照组轻。真皮替代物亦被表皮覆盖,表皮分层清晰,但表皮层较正常皮肤厚；真皮层胶原纤维排列有序,呈匀质性,无分层,真皮内炎性细胞少见,有成熟血管,缺乏毛囊和皮脂腺。真皮替代物移植创面4w后,其内荧光标记的成纤维细胞存活良好,仍具有活性。成纤维细胞与胶原凝胶混合后,成纤维细胞仍保持分泌活性,不断分泌细胞外基质,同时改造胶原结构,“真皮层”接种表皮细胞并经过气-液界面培养,表皮细胞成层并且向基底上层细胞分化,形成基底上层,进而形成表皮/真皮复合皮。3.脂肪组织来源干细胞及复合皮构建含皮下脂肪组织的多层皮肤复合组织脂肪组织来源干细胞与凝胶混合后细胞均匀分布在凝胶中的不同层次,成脂诱导15d后细胞内充满圆形脂滴,倒置显微镜可见细胞内透亮脂滴,油红O染色可见细胞内红色脂滴,HE染色可见细胞内脂滴空泡。表皮/真皮复合皮与脂肪组织层按正常皮肤结构顺序组装后形成具有表皮层、真皮层及皮下脂肪层的多层皮肤复合组织。表皮层连续并成复层,真皮层内细胞分布均匀,脂肪层内含脂滴的细胞均匀分布,两层间粘附牢固,交界处可见梭形细胞和含有空泡的细胞聚集。结论1.以脂肪组织中可分离获取血管基质片段(SVF),以而获得脂肪组织来源干细胞(ASCs), ASCs具有成脂、成骨、成软骨等干细胞多向分化潜能。2.成纤维细胞在Ⅰ型胶原凝胶三维复合培养中可发挥良好的细胞活性,细胞与胶原构建的活性真皮替代物可减少创面收缩及瘢痕形成,但与正常皮肤相比,缺乏皮肤附属器。在构建的真皮替代物上种植表皮细胞,可构建出表皮/真皮复合皮。3ASCs与Ⅰ型胶原凝胶支架在体内、外均可构建出脂肪样组织。4.成纤维细胞、表皮细胞与Ⅰ型胶原凝胶支架可构建出表皮/真皮复合皮,进而与构建的组织工程化脂肪按照正常皮肤结构顺序组装培养可构建出含有表皮层、真皮层及皮下脂肪层的皮肤复合组织。关键词：脂肪组织来源干细胞论文组织工程论文皮肤复合组织论文组织工程化皮肤论文脂肪组织工程论文
摘要3-10
ABSTRACT10-20
前言20-24
材料和策略24-33
结果33-45
讨论45-51
结论51-52
全文总结52-53