本站原创
摘要：人类Y染色体属于性染色体,为正常男性所特有,除拟常染区(pseudoautosomal region, PAR)外,在遗传历程中不发生重组,其序列结构除突变外由父代不变的传递给子代,同一父系人群的Y染色体在论述上相同。Y染色体的这一特性,使其在法医DNA检验和亲权鉴定方面有巨大运用潜力。同时由于其具有男性特异性,在实际办案中,对性侵犯、伤害等案件中提取到的男女混合检材进行鉴定时,Y染色体遗传标记检验技术更有其特殊的价值,能够获得男性个体Y染色体遗传信息同时不受女性成分影响。鉴于以上特点,Y染色体长期以来都是作为重要的探讨检验对象被运用于法医物证检验。针对Y染色体第二代遗传标记——短串联重复序列(STR, short tandem repeats)而进行的荧光标记复合扩增检验,是目前运用最广泛、技术最成熟的Y染色体遗传信息检验技术,具有操作简单、检测信息通量高、结果数字化显示易于存储比对等优点。基于这一技术而开发的各种商业化试剂盒,已经在法医DNA检验鉴定中得到广泛运用。2003年Promega公司推出的PowerPlexTM Y试剂盒在一个反应管中同时扩增12个Y-STRs基因座,其中包括IH (International Society of Forensic Haemogenetics)认定的欧洲MHL(最小单倍型,minimal haplotypes loci)的9个基因座及SWGDAM (美国DNA浅析策略科学工作组,Scientific Working Group On DNA Analysis Methods)推荐的11个基因座。2004年由ABI公司推出的AmpFISTR Y filerTM试剂盒,可以实现同步扩增检测17个Y-STR基因座。但这些现有的商业化试剂盒主要是按照欧洲人群统计选择的基因座位点,其中不少基因座的多态性在中国人群中比较低,如DYS391在中国人群中多态性小于0.4,加之基因座数量少,造成了系统整体个体识别能力低,在法医鉴定的实际运用中有时会遇到瓶颈,特别是近年随着DNA数据库的进展,比对样本基数的增加,Y-STR作为家系排查的主要比对指标,现有Y-STR检测系统识别率不足的缺点日益突出,影响了其数据库比对效能,出现了如嫌犯与多个不同家系的Y-STR单倍型匹配,造成无法排查的情况,或者由于Y-STR突变,造成家系比对无法确定或误判的情况。由此,开发一种针对中国人群的多态性高、性能稳定、操作简单和能同时检测更多基因座的Y-STR检测系统,成为我国法医物证检验鉴定的迫切需要。本论文根据过去十几年国内外针对中国人群Y-STR的探讨,选择针对中国男性的GD(基因多态性,gene diversity)数值较高的Y-STR基因座,建立了24个Y-STR基因座荧光标记复合扩增检测系统,有效提升Y-STR检测系统对中国人群的鉴别能力和效率,解决了现有Y-STR荧光检验试剂盒识别能力不足的难题。本论文通过查阅文献,以中选取DYS531、DYS630、DYS622、DYS552、 DYS510、DYS449、DYS459a/b、DYS446、DYS443、DYS587、DYS527a/b、 DYS460、Y-GATA-A10、DYS520、DYS557、DYS522、DYS481、 DYS444等未在现有商业试剂盒系统内、在中国人群中基因多态性高(GD0.6)、且等位基因跨度较小的基因座21个,考虑到需要与现有商业试剂盒联用,特地加入DYS635和DYS385a/b三个基因座,同时运用目前最先进的5色荧光标记,将24个基因座分成四组,利用6-FAM、HEX、TAMRA、ROX分组标记,分子量内标用第五色荧光染料SIZ(橙色荧光,无锡中德美联公司)标记,组成24个Y-STR基因座复合扩增系统。随后通过先对24个基因座的单一扩增条件进行优化,在成功地建立了单个基因座扩增条件的基础上,探讨24个基因座复合扩增PCR反应条件,通过实验确定了复合扩增系统的循环参数、缓冲液离子强度、酶量、复合扩增反应体积以及荧光标记引物浓度等,使扩增产物达到平衡、特异的要求,建立稳定、均衡的复合扩增系统,实现同时扩增24个Y-STR基因座。本论文通过编制GeneMapper ID3.2浅析文件panel、bins,利用混合单基因座扩增产物策略制作等位基因标准物ladder,利用5色荧光Matrix与SIZ-500内标,建立了基于ABI基因浅析仪的自动毛细管电泳检验策略。PCR扩增产物利用3130XL型遗传浅析仪进行电泳检测,用软件Foundation data collection收集原始扫描数据,GeneMapper ID3.2进行Y-STR基因分型。对24个Y-STR复合扩增系统的男性特异性、家系稳定性、种属特异性、灵敏度、人体细胞同一性等法医学运用相关指标进行了实验探讨,进一步验证了该系统特异性好、性能稳定、反应灵敏。本论文运用建立的24个Y-STR复合扩增检测系统,对146份广东地区无关男性个体进行检测,同时运用AmpFISTR YfilerTM试剂盒进行比较检测,得到Y-STR分型数据后,用直接计数法计算各等位基因频率。基因多态性(gene diversity, GD)及单倍型多样性(haplotype diversity, HD),按公式h=n(1-∑Pi2)/(n-1)计算(n为样本例数,Pi为等位基因频率)。并计算累积的GD值(TGD,相当于常染色体STR评估指标中的累积非父排除率CPE)按公式TGD=1-(1-GD1)(1-GD2)(1-GD3)(1-GD4)...(1-GDn)计算(GDn为各基因座的GD值)。24个Y-STR复合扩增系统共得到145种单倍型,其中144种单倍型出现1次,1种单倍型出现2次,单位点GD值为0.55(DYS531)-0.96(DYS385a/b)HD值为0.99972,TGD值为1-1.88E-14; YfilerTM系统的共得到143种单倍型,其中141种单倍型出现1次,1种单倍型出现2次,1种单倍型出现3次,单位点GD值为0.36(DYS389)-0.96(DYS385a/b), HD值为0.99858,TGD值为1-4.97E-9；24个Y-STR复合扩增系统与YfilerTM系统联用的共得到145种单倍型,其中144种单倍型出现1次,1种单倍型出现2次,HD值为0.99972,TGD值为1-1.066E-20。探讨表明,本论文建立的24个Y-STR复合扩增系统稳定、高效、操作简单易用,特异性强,可满足日常法医物证Y-STR检验需要,具有良好的中国人群针对性,系统识别率高于目前最常用的商业AmpFISTR YfilerTM试剂盒,能够很好的解决目前Y-STR商业试剂盒信息量少、个体识别率低的不足。本系统作为Y-STR检验补充手段,运用荧光标记毛细管电泳技术,可运用于目前国内绝大多数法医物证实验室,在法医物证案件检验、亲权鉴定与Y-STR数据库建设具有广泛的运用前景。关键词：Y染色体论文短串联重复序列论文DYS635DYS385a/b论文DYS531DYS630DYS622DYS552DYS510DYS449DYS459a/b论文DYS446DYS443DYS587DYS527a/b论文DYS460Y-GATA-A10DYS520DYS557DYS522DYS481DYS570DYS444荧光论文复合扩增论文法医学论文
摘要3-7
ABSTRACT7-13
前言13-18
第一章 Y-STR复合扩增系统基因座选择与系统设计18-25
1.1 技术路线18-19
1.2 位点选择19-21
1.3 引物设计和合成21-23
1.4 Matrix制作23-25
第二章 24个Y-STR复合扩增检测系统的建立25-45
一、材料与策略25-30
二、结果与浅析30-41
三、讨论41-45
第三章 24个Y-STR复合扩增系统的评价与法医学参数统计45-59
一、材料与策略45-50
二、结果50-54
三、讨论54-55
四、运用案例55-59
附表59-83
全文小结83-85