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试谈细胞IGF1对鸭胚肌肉发育影响与其分子机理科技

收藏本文 2024-01-19 点赞:24888 浏览:109215 作者:网友投稿原创标记本站原创

摘要:鸟类肌纤维发育与其他脊椎动物一样,其数量在胚胎期就基本固定下来,在动物出生后不再增加,出生以后肌肉产量的增加主要缘于肌纤维的增粗和变长。针对禽类卵生的生理特点,通过卵内注射营养物质到禽蛋气室、蛋白或胚胎中均可以影响禽类机体的生理、代谢以及发育等。很多外界因素对鸟类胚胎肌肉发育的影响都是通过影响IGF-1的表达而介导的。为进一步探究IGF-1对鸭胚胎肌肉发育的影响及其分子机理,本探讨采取卵内注射的策略将IGF-1注射到孵化的鸭蛋蛋白中,依次探讨卵内注射IGF-1对鸭成肌细胞增殖、卫星细胞激活、肌蛋白代谢相关基因表达等的影响,以及在细胞水平上浅析IGF-1实现上面陈述的作用的分子机制。具体探讨内容:(1)通过荧光定量PCR的策略检测主要肌源性基因在肌肉发育历程中的发育性表达方式,初步了解鸭胚胎期肌肉发育特点及与肌源性基因表达方式之间的联系;(2)通过卵内注射IGF-1到鸭蛋蛋白后,采取免疫荧光技术检测IGF-1对鸭胚胎肌肉不同发育阶段成肌细胞增殖、卫星细胞激活的影响,并运用荧光定量PCR技术检测IGF-1对肌肉发育和蛋白代谢相关基因表达的影响;(3)通过分离和培养鸭原代成肌细胞,采取细胞信号通路阻断剂Ly929402和RAPA分别阻断P13K和mTOR后,探讨IGF-1对FST基因以及其他通路关键基因表达的影响,浅析FST在IGF-1诱导成肌细胞增殖历程中的作用;(4)通过原核表达获得鸭重组FST蛋白,探讨其对肌肉发育以及肌肉发育相关基因表达的影响。主要结果和结论如下:(1)MRFs基因家族各个成员在鸭次级肌肉发育历程中呈规律性表达,其中MyoD和Myf5、MyoG与MRF4的表达方式分别一致,在肌肉发育历程分别执行差别的功能。另外,MRFs在鸭胸肌和腿肌中的表达方式有着差别,说明MRFs的表达特性还与肌纤维类型有关。在鸭胚次级肌肉发育历程中,IGF-1与FST的表达方式整体呈现一致性的变化,提示IGF-1与FST的功能有着一定联系,可能协同调控了肌肉发育历程。(2)卵内注射IGF-1可以影响鸭胚体重、肌肉重、肌纤维各种参数包括肌纤维直径、密度等;同时,卵内注射IGF-1还诱导了成肌细胞的增殖;IGF-1处理组胸肌和腿肌中MyoG和MRF4的表达水平都显著高于对照组,表明卵内注射IGF-1可以调控MyoG和MRF4的表达,进而诱导成肌细胞的分化,进一步诱导肌纤维肥大和增生并最终影响肌肉发育。另外,卵内注射IGF-1对鸭胸肌和腿肌的影响程度有着差别,推测与禽类胚胎期腿肌肌肉发育本身较快和禽类胸、腿肌的肌纤维组成特点有关。(3)卵内注射IGF-1能诱导出壳前后鸭胚的生长发育,尤其可以推动肌纤维的肥大和发育,主要依赖于IGF-1对卫星细胞激活的影响。IGF-1能够调控MyoD和Myf5的表达,进而诱导卫星细胞激活;激活的卫星细胞增殖后,融合进入肌纤维导致肌纤维肥大、增生而推动肌肉的发育。另外,IGF-1对鸭胚胸肌和腿肌发育影响程度是不同的,IGF-1对鸭腿肌中卫星细胞激活和增殖的影响显著要高于胸肌,表明IGF-1可能对慢肌类型肌纤维影响更显著。(4)卵内注射IGF-1能够上调鸭胚肌肉组织EIEF基因的表达,抑制蛋白降解历程相关基因MurF和MAFbx的表达,即卵内注射IGF-1可以通过诱导蛋白转录,抑制蛋白降解的历程实现对肌肉发育的调控。卵内注射IGF-1可以调控鸭肌蛋白代谢,进而影响肌肉的发育。在鸭胚卵内注射IGF-1后,细胞内质网蛋白质量调控系统一定程度上参与了调控作用,但具体机制还不清楚。(5)个体水平上,卵内注射IGF-1能上调FST基因表达,并且FST的表达以IGF-1浓度依赖的方式。细胞水平上,培养基中添加IGF-1也可以诱导FST的表达,但当采取Ly929402抑制PI3K后,而下游基因包括IGF-1R、 EIEF, mTOR、 MAFbx、 MurF、 MyoG、 MRF4、 ACVR1、 ACVR2等的表达都不同程度上发生了变化,而FST的表达变化不显著;当IGF-1处理历程中同时采取RAPA抑制mTOR后,FST的表达水平显著上调,上下游基因的表达也不同程度上发生了变化,表明IGF-1可以通过诱导FST的表达进而实现IGF-1对TGFβ信号通路的抑制作用,以上历程可能与P13K路径无关。一些未知路径可能参与了IGF-1对mTOR的调控,进而实现IGF-1对FST表达的调控。FST是IGF-1通路和TGFP信号通路之间相互作用的又一关键因子,可能是IGF-1实现对TGFβ通路中MSTN抑制作用的关键因子。(6)本探讨获得了鸭FST重组蛋白,并且该蛋白具有诱导鸭成肌细胞增生的生物活性;还发现卵内注射鸭FST重组蛋白对鸭胚肌肉发育不显著,但却能抑制MSTN的表达,以及上调MyoD、 Myf5、 Pax7等基因的表达水平,表明鸭FST重组蛋白在鸭胚胎时期肌肉发育中具有较重要的作用。关键词:胚胎肌肉发育论文鸭论文卵内注射论文IGF-1论文成肌细胞论文卫星细胞论文蛋白代谢论文

    摘要5-7

    ABSTRACT7-10

    主要符号说明10-16

    第一章 文献综述16-45

    1. 前言16

    2. 肌肉发育历程和发育动力16-25

    2.1 胚胎肌肉发育历程16-18

    2.2 成肌细胞增殖18-19

    2.3 卫星细胞19-22

    2.4 肌蛋白代谢22-23

    2.5 肌纤维分化23-25

    3. 参与胚胎肌肉发育调控的相关基因和信号通路25-34

    3.1 肌转录因子25-30

    3.2 参与肌肉发育的主要信号通路30-34

    4. IGF-1与肌肉发育34-37

    4.1 IGF-1在肌肉发育中作用34-36

    4.2 IGF-1与肌肉发育相关基因和通路的调控联系36-37

    5. 禽类胚胎肌肉发育的探讨37-43

    5.1 影响动物胚胎发育的外界因素37-39

    5.2 禽类胚胎发育探讨相关技术和模型39-41

    5.3 外界因素对禽类胚胎发育影响的理由浅析41-42

    5.4 卵内注射IGF-1与禽类胚胎肌肉发育42-43

    6. 探讨的目的作用、内容及探讨思路43-45

    6.1 探讨目的、作用43

    6.2 探讨内容43-44

    6.3 探讨思路44-45

    第二章 鸭胚次级肌肉发育历程肌纤维发育特点及MRFs、IGF-1和FST发育性表达方式浅析45-60

    1. 前言45-46

    2. 材料与策略46-52

    2.1 实验样品采集46

    2.2 主要试剂与实验仪器46-48

    2.3 测定指标及策略48-52

    2.4 数据统计与浅析52

    3. 结果52-56

    3.1 鸭胚次级肌肉发育历程中肌纤维形态观察52-54

    3.2 胚胎肌肉发育历程中主要基因发育性表达54-56

    4. 讨论56-58

    4.1 MRFs与鸭胚肌肉发育56-57

    4.2 FST与鸭胚肌肉发育57-58

    4.3 IGF-1和IGF-1R与鸭胚肌肉发育58

    5. 小结58-60

    第三章 卵内注射IGF-1对鸭胚成肌细胞增殖和分化的影响60-74

    1. 前言60-61

    2. 材料与策略61-63

    2.1 实验样品处理与采集61

    2.2 主要试剂与实验仪器61-62

    2.3 测定指标及测定策略62-63

    2.4 数据统计与浅析63

    3. 结果63-70

    3.1 卵内注射IGF-1对鸭胚重和肌肉重的影响63-64

    3.2 卵内注射IGF-1对鸭胚肌肉组织形态以及肌纤维参数的影响64-67

    3.3 IGF-1对成肌细胞增殖的影响67-69

    3.4 卵内注射IGF-1对MyoG和MRF4表达方式的影响69-70

    4. 讨论70-72

    4.1 卵内注射IGF-1影响了鸭胚次级肌肉发育70-71

    4.2 卵内注射IGF-1诱导成肌细胞的增殖,并最终导致次级肌肉肥大和增生71-72

    4.3 卵内注射IGF-1对鸭腿肌和胸肌发育影响的比较与浅析72

    5. 小结72-74

    第四章 卵内注射IGF-1对鸭肌肉卫星细胞的影响74-92

    1. 前言74-75

    2. 材料与策略75-77

    2.1 动物处理与实验样品采集75

    2.2 主要试剂与实验仪器75-76

    2.3 测定指标及测定策略76-77

    2.4 数据统计与浅析77

    3. 结果77-87

    3.1 卵内注射IGF-1对鸭出壳前后体重的影响77-79

    3.2 IGF-1对鸭出壳前后肌纤维参数的影响79-81

    3.3 卵内注射IGF-1对鸭卫星细胞激活的影响81-83

    3.4 卵内注射IGF-1对卫星细胞增殖的影响83-86

    3.5 卵内注射IGF-1对肌转录因子MyoD和Myf5表达的影响86-87

    4. 讨论87-91

    4.1 卵内注射IGF-1推动鸭出壳前后肌纤维肥大和增生87

    4.2 卵内注射IGF-1增加鸭肌肉卫星细胞激活率和增殖率87-89

    4.3 IGF-1可诱导肌转录因子MyoD和Myf5的表达89

    4.4 卵内注射IGF-1在鸭胸肌和腿肌中的作用差别比较89-91

    5. 小结91-92

    第五章 卵内注射IGF-1对蛋白代谢、蛋白质量调控等相关基因表达的影响92-103

    1. 前言92-93

    2. 材料与策略93-95

    2.1 实验样品处理与采集93

    2.2 主要试剂和仪器93

    2.3 测定指标及测定策略93-95

    2.4 数据浅析95

    3. 结果95-99

    3.1 卵内注射IGF-1对肌肉样品蛋白含量的影响95-96

    3.2 卵内注射IGF-1对肌蛋白代谢相关基因表达的影响96-99

    4. 讨论99-102

    5. 小结102-103

    第六章 IGF-1以FST为介导调控成肌细胞增殖和肌纤维肥大103-123

    1. 前言103-104

    2. 材料与策略104-108

    2.1 主要试剂和仪器104-105

    2.2 实验历程105-106

    2.3 指标检测106-108

    2.4 数据浅析108

    3. 结果108-118

    3.1 鸭原代成肌细胞分离、培养、鉴定及特性浅析108-111

    3.2 卵内注射不同浓度IGF-1对FST表达及肌肉发育的影响111-112

    3.3 IGF-1对鸭成肌细胞增殖及FST表达的影响112-118

    4. 讨论118-122

    4.1 鸭成肌细胞的分离与培养118-119

    4.2 IGF-1对FST表达的调控119-122

    5. 小结122-123

    第七章 重组鸭FST蛋白在鸭胚肌肉发育中的作用探讨123-136

    1. 前言123

    2. 材料与策略123-127

    2.1 主要试剂与仪器123-124

    2.2 实验步骤124-125

    2.3 基因表达浅析125-127

    2.4 数据浅析127

    3. 结果127-133

    3.1 原核表达载体的构建及蛋白纯化和鉴定127-129

    3.2 鸭FST重组蛋白的活性浅析129-130

    3.3 卵内注射鸭FST重组蛋白对鸭胚肌肉发育的影响130-132

    3.4 卵内注射鸭FST重组蛋白对鸭胚肌肉发育相关基因表达的影响132-133

    4. 讨论133-135

    5. 小结135-136

    第八章 总结136-141

    1 本探讨的主要结果和结论136-137

    2. 本探讨的革新之处137-139

    2.1 以鸭为探讨模型137

    2.2 较全面探讨了鸭胚胎肌肉发育的特点137-138

    2.3 结合禽类特点,采取卵内注射的探讨方式138

    2.4 探讨思路的革新138-139

    3. 还需要改善和解决的不足139-141

    3.1 IGF-1诱导肌肉发育分子机理需要进一步阐述139

    3.2 部分实验技术有待于更新139

    3.3 对运用此方面探讨成果的深思139-141

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