本站原创论新点5-9
摘要9-12
Abstract12-16
第一章 前言16-36
1 HBV的探讨概况16-26
1.1 HBV病毒以及在体内外的感染16-18
1.1.1 HBV的结构与组成16
1.1.2 HBV传播方式和宿主范围16-17
1.1.3 HBV的体内外感染17-18
1.2 HBV复制周期18-24
1.2.1 吸附和进入18-19
1.2.2 松弛环状DNA的入核19
1.2.3 共价闭合环状DNA的形成和维持19-21
1.2.4 病毒RNA复制21-23
1.2.5 病毒子代DNA合成23-24
1.3 乙型肝炎的治疗与探讨24-26
2 MAPK-HNF4α通路与与HBV复制的相互联系26-30
2.1 MAPK-ERK通路27-28
2.2 MAPK-JNK通路28
2.3 MAPK-p38通路28-29
2.4 MAPK-HNF4α通路与HBV复制的联系29-30
3 阳离子宿主防御肽抗病毒探讨概况30-35
4 本工作出发点35-36
第二章 抗HBV多肽Mucroporin-M1的筛选36-43
2.1 引言36
2.2 材料与策略36-39
2.2.1 实验材料,试剂和仪器36-38
2.2.1.1 细胞系36-37
2.2.1.2 细胞培养基以及相关溶液配制37
2.2.1.3 蝎毒素多肽的合成37
2.2.1.4 Epsa试剂盒37-38
2.2.1.5 实验仪器38
2.2.2 实验策略38-39
2.2.2.1 细胞培养38
2.2.2.2 多肽抑制HBV活性筛选38-39
2.2.2.3 多肽序列浅析39
2.3 实验结果39-42
2.3.1 Mucroporin-M1以及其他多肽的分离鉴定39-41
2.3.2 抗HBV多肽Mucroporin-M1的鉴定41-42
2.4 讨论42-43
第三章 Mucroporin-M1多肽体外抑制HBV的复制43-67
3.1 引言43-44
3.2 材料与策略44-59
3.2.1 实验材料,试剂和仪器44-45
3.2.1.1 细胞系44
3.2.1.2 质粒44
3.2.1.3 抗体44
3.2.1.4 试剂和试剂盒44-45
3.2.1.5 实验仪器45
3.2.2 实验策略45-59
3.2.2.1 大肠杆菌感受态制备45
3.2.2.2 细胞毒性检测45-46
3.2.2.3 细胞上清HBeAg和HBsAg检测46-47
3.2.2.4 细胞上清中的HBV DNA检测47-48
3.2.2.5 Western blot检测HBV Core蛋白48-50
3.2.2.6 Northern blot 检测 HBV RNA50-56
3.2.2.7 Southern blot 检测 HBV DNA56-59
3.3 实验结果59-65
3.3.1 Mucroporin-M1对细胞生长的影响59-60
3.3.2 Mucroporin-M1对细胞上清中病毒的抑制效应60-62
3.3.2.1 Mucroporin-M1对细胞上清中HBeAg和HBsAg的抑制效应60-61
3.3.2.2 Mucroporin-M1对细胞上清中HBV DNA的抑制效应61-62
3.3.3 Mucroporin-M1对细胞内HBV病毒的抑制62-65
3.3.3.1 Mucroporin-M1抑制细胞内HBV Core蛋白的表达62-63
3.3.3.2 Mucroporin-M1对细胞内HBV DNA的浓度依赖抑制效应63-64
3.3.3.3 Mucroporin-M1抑制细胞内HBV RNA的表达64-65
3.4 讨论65-67
第四章 Mucroporin-M1多肽抑制小鼠体内HBV的复制67-74
4.1 引言67
4.2 材料与策略67-69
4.2.1 实验材料,试剂和仪器67-68
4.2.1.1 实验动物67
4.2.1.2 实验试剂和材料67-68
4.2.2 实验策略68-69
4.2.2.1 BALB/c小鼠急性HBV感染模型构建及多肽处理68
4.2.2.2 小鼠血液中HBeAg和HBsAg抗原检测68-69
4.2.2.3 组织切片和免疫组化69
4.3 实验结果69-72
4.3.1 Mucroporin-M1多肽对小鼠血清中HBeAg和HBsAg的抑制69-71
4.3.2 Mucroporin-M1多肽抑制小鼠肝细胞中HBcAg的表达71-72
4.4 讨论72-74
第五章 Mucroporin-M1体外抑制HBV复制的作用机制74-97
5.1 引言74
5.2 材料与策略74-85
5.2.1 实验材料,试剂和仪器74-77
5.2.1.1 质粒74-76
5.2.1.2 试剂76
5.2.1.3 试剂盒76
5.2.1.4 实验仪器76-77
5.2.2 实验策略77-85
5.2.2.1 细胞总RNA的提取77
5.2.2.2 cDNA一链的反转录合成77
5.2.2.3 实时定量PCR77-79
5.2.2.4 超纯质粒的提取79
5.2.2.5 双荧光素酶实验79-81
5.2.2.6 凝胶阻滞实验81-84
5.2.2.7 Western blot检测HNF4α84-85
5.2.2.8 细胞MAPK通路的检测85
5.2.2.9 MAPK抑制剂对HBV DNA影响的检测85
5.3 实验结果85-94
5.3.1 Mucroprin-M1多肽抑制HBV病毒启动子转录活性85-87
5.3.2 Mucroprin-M1对反式转录因子结合HBV启动子顺式元件的影响87-89
5.3.3 Mucroprin-M1抑制HNF4α的表达89-90
5.3.4 Mucroprin-M1对MAPK通路的激活作用90-92
5.3.5 MAPK通路抑制剂对Mucropr in-M1激活MAPK通路作用的阻断92-94
5.4 讨论94-97
第六章 Mucroporin-M1抑制小鼠体内HBV复制的作用机制97-102
6.1 引言97
6.2 材料与策略97-99
6.2.1 实验材料,试剂和仪器97-98
6.2.1.1 实验动物97-98
6.2.1.2 实验试剂和材料98
6.2.2 实验策略98-99
6.2.2.1 BALB/c小鼠急性HBV感染模型构建及多肽处理98
6.2.2.2 小鼠肝脏细胞蛋白提取和制样98-99
6.2.2.3 Western blot检测MAPK蛋白和HBV Core蛋白99
6.3 实验结果99-100
6.4 讨论100-102
实验总结与展望102-104