联用糖尿病大鼠模型和抗糖尿病药物作用机制代谢组学

摘要：代谢组学是一门系统探讨在外界刺激或遗传修饰下机体代谢应答及其随时间变化规律的学科。代谢物组是蛋白质组、转录组和基因组总体表达的结果,直接反映组织的生化状态,能够较灵敏地刻画生命体生理病理状态的变化,对于阐明生命复杂系统具有及其重要的作用。作为崭新的策略学,代谢组学已在医药学、生物学等众多领域得到广泛运用。由此用代谢组学的策略来探讨复杂疾病包括代谢性疾病,对于疾病的早期诊断、预防、药物干预具有重要的指导作用。Ⅱ型糖尿病又称非胰岛素依赖性糖尿病,是一种以高血糖为特点的慢性代谢紊乱疾病,约占糖尿病患者的90%。目前全球已诊断的Ⅱ型糖尿患者已达1.3亿,在我国,2007年糖尿病的患病人数已超过3980万,其中Ⅱ型糖尿病占93.7%,并且正随着人民生活水平的提升、人口老化及生活方式的转变而不断增加。本探讨建立模拟人类Ⅱ型糖尿病发病机制的实验型糖尿病大鼠模型,并采取超高效液相色谱-质谱联用(Uplc/MS)、核磁共振(NMR)等代谢组学浅析技术测定了对照、高脂和Ⅱ型糖尿病模型大鼠血清、尿液及粪样的代谢物谱。采取多元统计浅析及方式识别策略寻找出与Ⅱ型糖尿病相关的生物标记物,为临床上Ⅱ型糖尿病的诊断提供依据。探讨了给予降糖药盐酸二甲双胍、阿卡波糖和盐酸米格列奈后Ⅱ型糖尿病大鼠血清、尿液及粪样代谢物谱的变化,探讨了这三种降糖药物的作用机制,为新药研发提供参考。一、Ⅱ型糖尿病大鼠模型的建立Wistar大鼠经高脂高糖饲料喂养六周后,小剂量(30mg／kg)注射链脲佐菌素(STZ)诱导Ⅱ型糖尿病大鼠模型。结果表明仅高脂高糖饲料喂养后的大鼠血清中空腹血糖水平未见显著升高,而血清中甘油三酯水平显著增高、胰岛素水平降低。说明给予高脂高糖饮食喂养可导致胰岛素抵抗的发生。高脂高糖饲料喂养后,再给予链脲佐菌素诱导后大鼠空腹血糖显著增加,成功建立了Ⅱ型糖尿病大鼠模型。所建立的Ⅱ型糖尿病模型与文献报道的策略相比成模率较高(80%),死亡率减少。二、Ⅱ型糖尿病模型大鼠给药前后血清代谢物谱的UPLC/MS浅析建立了适用血清代谢物谱探讨的超高效液相色谱-质谱联用法(UPLC/MS)并用于对照大鼠、高脂大鼠及Ⅱ型糖尿病模型大鼠血清代谢物谱的浅析。采取主成分浅析策略(PCA)等方式识别策略对对照大鼠、高脂大鼠及Ⅱ型糖尿病模型大鼠血清代谢物谱进行分类并以血清中寻找与Ⅱ型糖尿病相关的生物标记物。所建立的策略能将三组大鼠完全分离,糖尿病模型组大鼠血清中16：0、18：0、18：2溶血磷脂酰胆碱和苯丙氨酸水平相对于对照大鼠显著增加。将所建立的浅析策略运用于抗糖尿病药物盐酸二甲双胍、阿卡波糖、盐酸米格列奈干预后的Ⅱ型糖尿病模型大鼠血清代谢物谱探讨,结果给予三种降糖药物干预后,Ⅱ型糖尿病模型大鼠血清中溶血磷脂酰胆碱和苯丙氨酸水平均有所降低。血清中溶血磷脂酰胆碱水平可能与氧化应激有关,糖尿病模型大鼠及给予抗糖尿病药物治疗后的模型大鼠血清中溶血磷脂酰胆碱水平的变化体现了体内氧化应激的转变。三、Ⅱ型糖尿病模型大鼠给药前后尿液代谢物谱的UPLC/MS浅析建立了适用于尿液代谢物谱浅析的UPLC/MS法并用于对照大鼠、高脂大鼠及Ⅱ型糖尿病模型组大鼠尿液代谢物谱探讨。采取主成分浅析法等方式识别技术对对照大鼠、高脂大鼠及Ⅱ型糖尿病模型组大鼠尿液代谢物谱进行分类并以尿液中寻找与Ⅱ型糖尿病相关的生物标记物。所建立的策略能将对照、高脂和模型组大鼠成功区分,Ⅱ型糖尿病模型大鼠尿液中肌酸酐、柠檬酸盐、马尿酸盐、苯乙酰甘氨酸显著降低而鹅去氧胆酸、去氧胆酸和胆酸显著升高。抗糖尿病药物盐酸二甲双胍、阿卡波糖、盐酸米格列奈治疗后这些代谢物均有向正常恢复的走势。Ⅱ型糖尿病模型大鼠及给予抗糖尿病药物治疗后的模型大鼠尿液中肌酸酐、柠檬酸盐、马尿酸盐、苯乙酰甘氨酸、鹅去氧胆酸、去氧胆酸和胆酸水平的变化提示可能有着胆汁酸代谢、能量代谢和肠道菌群代谢的转变。四、Ⅱ型糖尿病模型大鼠给药前后粪样代谢物谱的UPLC/MS浅析建立了适用于粪样代谢物谱浅析的UPLC/MS法并用于对照大鼠、高脂大鼠及Ⅱ型糖尿病模型组大鼠的粪样代谢物谱探讨。采取主成分浅析法等方式识别技术对对照大鼠、高脂大鼠及Ⅱ型糖尿病模型组大鼠粪样代谢物谱进行分类并以粪样中寻找与Ⅱ型糖尿病相关的生物标记物。所建立的策略能将对照、高脂和模型组大鼠成功区分,糖尿病模型组大鼠粪样中熊去氧胆酸、胆酸、苯丙氨酸显著增加。将所建立的浅析策略运用于抗糖尿病药物盐酸二甲双胍、阿卡波糖、盐酸米格列奈治疗后的Ⅱ型糖尿病模型大鼠粪样代谢物谱探讨。给予抗糖尿病药物治疗后的大鼠粪样中熊去氧胆酸、胆酸和苯丙氨酸均有所降低。Ⅱ型糖尿病模型大鼠及给予抗糖尿病药物治疗后的模型大鼠粪样中胆汁酸和苯丙氨酸水平的变化表明大鼠体内胆固醇代谢和营养代谢的变化。五、Ⅱ型糖尿病模型大鼠给药前后尿液代谢物谱的NMR浅析建立了适用于尿液代谢物谱探讨的NMR法并用于对照大鼠、高脂大鼠及Ⅱ型糖尿病模型组大鼠的尿液代谢物谱探讨。采取主成分浅析法等方式识别技术对对照大鼠、高脂大鼠及Ⅱ型糖尿病模型组大鼠尿液代谢物谱进行分类。所建立的策略能将对照、高脂和模型组大鼠成功区分,测得Ⅱ型糖尿病模型大鼠尿液中葡萄糖和牛磺酸浓度显著增高,柠檬酸盐、肌酸酐、乳酸盐和醋酸盐浓度显著降低。采取NMR技术对尿液代谢物谱进行探讨,既得到了与Uplc／MS法相同的标记物又得到了新的标记物。探讨表明采取多种浅析技术进行代谢组学探讨能更全面深入的了解Ⅱ型糖尿病的发病机制及降糖药物的作用机制。六、健康志愿者给予二甲双胍前后血浆代谢物谱的UPLC/MS浅析将所建立的测定血清代谢物谱的UPLC/MS法用于探讨服用二甲双胍前后的健康志愿者的血浆代谢物谱的变化,能准确地将服药前与服药后的健康志愿者分离,所得到的标记物与采取Ⅱ型糖尿病模型大鼠进行探讨的标记物相同。表明所建立的浅析策略可成功运用于临床探讨。关键词：代谢组学论文Ⅱ型糖尿病模型论文生物标记物论文超高效液相色谱-质谱联用论文核磁共振论文

摘要12-15

Abstract15-18

第一章 绪论18-32

1.1 代谢组学18-25

1.1.1 代谢组学的涵义18

1.1.2 代谢组学与其他组学的联系18-19

1.1.3 代谢组学的探讨策略19-23

1.1.4 代谢组学在药学中的运用23-25

1.2 糖尿病25-29

1.2.1 糖尿病的定义25

1.2.2 糖尿病的分类25-26

1.2.3 糖尿病的发病机理26-27

1.2.4 糖尿病的症状27-28

1.2.5 糖尿病的治疗药物28-29

1.3 Ⅱ型糖尿病代谢组学的探讨作用29

1.4 糖尿病代谢组学的探讨近况29-30

1.5 本论文的探讨目的及案例30-32

第二章 Ⅱ型糖尿病实验动物模型的建立32-36

2.1 材料和策略32-33

2.2 实验结果33-35

2.2.1 高脂高糖饮食对大鼠各项指标的影响33-34

2.2.2 造模后大鼠空腹血糖及成模率34-35

2.3 讨论35

2.4 本章小结35-36

第三章 Ⅱ型糖尿病模型大鼠给药前后血清代谢物谱的UPLC/MS浅析36-59

3.1 Ⅱ型糖尿病模型大鼠血清代谢物谱的浅析36-49

3.1.1 材料36

3.1.2 策略36-38

3.1.2.1 血清样本采集36-37

3.1.2.2 血清样本制备37

3.1.2.3 血清代谢谱浅析条件37

3.1.2.4 血清代谢谱数据处理策略37-38

3.1.3 结果38-48

3.1.3.1 大鼠血清代谢物谱浅析的策略验证38-41

3.1.3.2 大鼠血清代谢物的鉴定41-43

3.1.3.3 Ⅱ型糖尿病模型大鼠血清的主要标记物43-48

3.1.4 讨论48-49

3.2 Ⅱ型糖尿病模型大鼠给药后血清代谢物谱的UPLC/MS浅析49-58

3.2.1 材料49

3.2.2 策略49-50

3.2.3 结果50-57

3.2.3.1 Ⅱ型糖尿病模型大鼠经二甲双胍治疗后血清代谢物谱的变化50-52

3.2.3.2 Ⅱ型糖尿病模型大鼠经阿卡波糖治疗后血清代谢物谱的变化52-54

3.2.3.3 Ⅱ型糖尿病模型大鼠经米格列奈治疗后血清代谢物谱的变化54-57

3.2.4 讨论57-58

3.3 本章小结58-59

第四章 Ⅱ型糖尿病模型大鼠给药前后尿液代谢物谱的UPLC/MS浅析59-93

4.1 Ⅱ型糖尿病模型大鼠尿液代谢物谱探讨59-80

4.1.1 材料59

4.1.2 策略59-61

4.1.2.1 尿液样本采集59

4.1.2.2 尿样处理策略59-60

4.1.2.3 尿液代谢谱浅析条件60-61

4.1.2.4 尿液代谢谱数据处理策略61

4.1.3 结果61-78

4.1.3.1 固相萃取法测定大鼠尿液代谢物谱浅析的策略验证61-64

4.1.3.2 固相萃取法测得Ⅱ型糖尿病模型大鼠尿液的主要标记物64-69

4.1.3.3 固相萃取法测得Ⅱ型糖尿病模型大鼠尿液主要标记物的变化69-70

4.1.3.4 直接稀释法测定大鼠尿液代谢物谱浅析的策略验证70-73

4.1.3.5 直接稀释法测得的Ⅱ型糖尿病模型大鼠尿液的主要标记物73-77

4.1.3.6 直接稀释法测得的Ⅱ型糖尿病模型大鼠尿液主要标记物的变化77-78

4.1.4 讨论78-80

4.2 Ⅱ型糖尿病模型大鼠给药后尿液代谢物谱的Uplc/MS浅析80-92

4.2.1 材料80

4.2.2 策略80

4.2.3 结果80-92

4.2.3.1 Ⅱ型糖尿病模型大鼠经二甲双胍治疗后尿液代谢物谱的变化80-84

4.2.3.2 Ⅱ型糖尿病模型大鼠经阿卡波糖治疗后尿液代谢物谱的变化84-88

4.2.3.3 Ⅱ型模型糖尿病大鼠经米格列奈治疗后尿液代谢物谱的变化88-92

4.2.4 讨论92

4.3 本章小结92-93

第五章 Ⅱ型糖尿病模型大鼠给药前后粪样代谢物谱的UPLC/MS浅析93-110

5.1 Ⅱ型糖尿病模型大鼠粪样代谢物谱的UPLC/MS浅析93-100

5.1.1 材料93

5.1.2 策略93-94

5.1.3 结果与讨论94-99

5.1.3.1 大鼠粪样代谢物谱浅析的策略学验证94-96

5.1.3.2 大鼠粪样中代谢物的鉴定96-97

5.1.3.3 型糖尿病模型大鼠粪样代谢物谱的主要标记物97-99

5.1.4 讨论99-100

5.2 Ⅱ型糖尿病模型大鼠经抗糖尿病药物干预后粪样代谢谱的UPLC/MS浅析100-109

5.2.1 材料100

5.2.2 策略100

5.2.3 结果100-108

5.2.3.1 Ⅱ型糖尿病模型大鼠经二甲双胍治疗后粪样代谢物谱的变化100-104

5.2.3.2 Ⅱ型糖尿病模型大鼠经阿卡波糖治疗后粪样代谢物谱的变化104-106

5.2.3.3 Ⅱ型糖尿病模型大鼠经米格列奈治疗后粪样代谢物谱的变化106-108

5.2.4 讨论108-109

5.3 本章小结109-110

第六章 Ⅱ型糖尿病模型大鼠尿液代谢物谱的NMR浅析110-120

6.1 材料110

6.2 策略110-111

6.3 结果111-118

6.3.1 NMR测得Ⅱ型糖尿病模型大鼠尿液代谢物谱的变化111-115

6.3.2 NMR测得Ⅱ型糖尿病模型大鼠尿液的主要标记物115-118

6.4 讨论118-119

6.5 本章小结119-120

第七章 健康志愿者给予二甲双胍前后血浆UPLC/MS浅析120-125

7.1 试验对象120

7.2 材料120

7.3 策略120-121

7.4 结果121-123

7.4.1 健康志愿者服用二甲双胍前后的血浆代谢物谱121-122

7.4.2 健康志愿者服用二甲双胍后的血浆主要标记物122-123

7.5 讨论123-125

第八章 结论125-128