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摘要：破骨细胞抑制性凝集素(OCIL)是近年来新发现的一种重要的破骨细胞抑制因子。大鼠OCIL是一种由233个氨基酸组成Ⅱ型跨膜C型凝集素,其组织分布与RANKL/OPG系统非常相似。体外探讨表明OCIL可以剂量依赖方式减少由RANKL和M-C诱导的破骨细胞样细胞的生成,抑制骨吸收陷窝的形成,但它并不能象OPG那样中和RANKL,提示OCIL对破骨细胞分化的阻断作用可能是直接的。鉴于OCIL强烈抑制破骨细胞分化的功能,科学家预测它有可能开发为骨质疏松防治药物。但是目前OCIL抑制破骨细胞分化和骨吸收的机制还不清楚,它不能中和RANKL,也不影响(?)RANKL/OPG的表达水平。另外,PGE2、1,25(OH)2D3、PTH和维甲酸等可显著上调成骨细胞中OCIL的表达,但具体的调节机制目前尚未阐明。为此,本论文分三部分对成骨细胞中OCIL基因的表达调控机制和OCIL抑制破骨细胞发育的分子机理进行了探究。第一部分,我们进行了有关PTHrp对成骨细胞中OCIL基因表达的调节及其分子机制的探讨。我们利用Real-time PCR技术探讨发现PTHrp(1-34)以剂量和时间依赖的方式推动UMR106成骨细胞样细胞中OCIL mRNA的表达,而且PTHrp(1-34)对OCIL mRNA表达调节的起始和达高峰的时相均晚于PTHrp(1-34)对RANKL的诱导和对OPG的抑制。另外我们还通过Western blotting浅析证实：PTHrp(1-34)能轻度推动小鼠MC3T3-E1细胞中OCIL蛋白的表达。为进一步明确何种信号通路介导了PTHrp(1-34)诱导的大鼠成骨细胞OCIL基因表达,我们采取不同信号通路的激动剂和阻断剂处理细胞,运用实时荧光定量PCR技术检测OCIL mRNA的表达水平。结果发现：RNA合成抑制剂放线菌素D几乎能够完全取消PTHrp(1-34)引发的OCIL mRNA表达；而蛋白合成抑制剂放线菌酮CHX显著上调PTHrp诱导的OCIL表达,但较CHX单独作用引起的OCIL mRNA水平升高呈现出降低的走势。我们还证实：cAMP/PKA信号通路激动剂PTH(1-31)、FSK和db-cAMP均推动OCIL mRNA的表达；钙离子载体A23187也能显著诱导OCIL的表达；而相比之下PKC信号通路激动剂PMA短时间作用减弱OCIL的表达,长时间作用诱导OCIL的表达。而特异性的PKA抑制剂KT5720、MAPK抑制剂PD98059、钙调蛋白抑制剂W-7和钙调蛋白激酶抑制剂KN-62均能显著阻断PTHrp诱导的OCIL表达。另一方面,PKC信号通路抑制剂chelerythrine能显著上调PTHrp(1-34)诱导的OCIL mRNA表达。而且,PD98059能够阻断db-cAMP诱导的OCIL表达,但它对A23187诱导的OCIL水平增高没有影响。这些结果说明在细胞水平,PTHrp(1-34)能够推动OCIL的表达；cAMP/PKA, Ca2+/CaMK Ⅱ和MAPK信号通路参与了PTHrp(1-34)对OCIL基因诱导表达的调节。第二部分,为深入探讨成骨细胞中OCIL基因表达调控的分子机制,鉴定调控OCIL基因表达的转录元件,我们将大鼠OCIL基因5’旁侧区长约4.5Kbp(-4370-+118bp)的DN段,克隆入荧光素酶报告基因pGL3-Basic的上游,并瞬时转染入三种内源OCIL mRNA表达水平不同的细胞,即大鼠UMR106成骨细胞系、原代大鼠成骨细胞和大鼠脑胶质瘤C6细胞系,结果发现三种细胞荧光素酶活性水平的差别与这三者中OCIL mRNA水平的差别一致,说明大鼠OCIL基因的表达调控主要发生在转录水平。在此基础上我们构建了大鼠OCIL启动子报告基因载体的5’端系列缺失体,通过转染实验发现：这些启动子缺失体具有不同程度的转录活性,由此我们初步确定了OCIL基因最小启动子序列和OCIL启动子上可能有着重要调节元件的区域。为下一步寻找和鉴定OCIL基因启动子中PTHrp的反应区域和核心应答元件奠定了良好的基础,同时也为今后深入探讨PTHrp或其它骨代谢调节因子对OCIL基因表达的调控机制提供了一个方便、有力的探讨手段。第三部分,我们首先利用本室原有已构建的含小鼠OCIL基因cDNA全长序列的pMal/mOCIL质粒为模板,经PCR扩增获得小鼠OCIL基因的编码序列。而后以化学合成的Igk+的信号肽序列和nOCIL为模板,利用二者间互补的18个碱基,经过重叠延伸PCR使二者拼接为融合基因。接下来,将融合基因sig-mOCIL克隆入真核表达载体pcDNA3.1,重组表达载体转染CHO细胞,G418加压培养筛选稳定表达细胞。进行基因整合鉴定后用整合有pcDNA3.1/sig-mOCIL的CHO细胞条件培养基干预PTHrp诱导培养的小鼠骨髓细胞,发现：重组OCIL蛋白对PTHrp诱导的破骨细胞样细胞生成和破骨细胞特异性基因TRAP、MMP-9、CTSK mRNA的表达增高有显著的抑制作用,提示OCIL基因可能通过影响TRAP、MMP-9、 CTSK mRNA的表达来抑制破骨细胞分化和活性。本实验为今后进一步深入探讨OCIL影响破骨细胞发育和功能的分子机制奠定了基础。关键词：激素相关肽论文破骨细胞抑制性凝集素论文细胞外信号论文基因表达启动子论文荧光素酶报告基因论文中国仓鼠卵巢细胞论文信号肽论文
中文摘要4-6
Abstract6-11
符号说明11-13
前言13-15
探讨近况、成果13-14
探讨目的、策略14-15
一、激素相关肽对大鼠成骨细胞OCIL基因表达的调节及其信号通路的探讨15-60
1.1 对象和策略15-29
1.2 结果29-48
1.3 讨论48-59
1.4 小结59-60
二、大鼠OCIL基因启动子的克隆及功能浅析60-83
2.1 对象和策略60-70
2.2 结果70-77
2.3 讨论77-82
2.4 小结82-83
三、小鼠OCIL基因的重组及对破骨细胞发育的影响83-98
3.1 对象和策略83-90
3.2 结果90-94
3.3 讨论94-97
3.4 小结97-98
结论98-99