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摘要：胃肠动力性疾病是一种由神经支配调节障碍所致的胃肠动力或感觉疾病,可能伴有内脏感知的异常。以神经胃肠病学为基础,曼谷新分类按神经损害部位及动力异常特点进行分类,即是原发于胃肠神经元或肌源性动力病和继发于全身器质性病的胃肠动力病。Cajal间质细胞(ICC)是胃肠道的一种问质细胞。ICC主要具有起搏功能和介导神经传递的作用,在胃肠动力的调节中起着重要的作用。ICC的形态转变、数量异常和网络结构的转变与许多胃肠道动力疾病密切相关,如慢传输型便秘、检测性肠梗阻、先天性巨结肠和糖尿病胃轻瘫等。ICC形态和/或数量的转变可能导致胃肠道动力障碍。ICC具有可塑性,干细胞生长因子可以促使ICC表型恢复。由此,植入ICC或促使ICC形态和功能的恢复,可用来治疗某些胃肠动力性疾病。近来探讨表明,IL-9、NO和5-HT等可推动ICC的生长和发育。神经生长因子(NGF)是神经营养因子家族的一种蛋白,其对中枢和外周神经系统的发育和功能维持具有重要的作用。NGF对损失神经有再生修复的作用。于是我们检测设：NGF可能推动ICC的增殖,或者调节ICC起搏电流,以而影响胃肠道动力。目的1.原代组织块培养ICC,并进行免疫荧光和亚甲蓝鉴定。2.探讨NGF对原代培养ICC数量和网络结构的影响。3.探讨NGF对原代培养ICC起搏电流和氯电流的调节。策略1.采取组织块培养法原代培养ICC。取新生鼠近端空肠,仔细分离出平滑肌肌条,切成0.5x0.5mm2大小的组织块。将组织块置于含有圆形盖玻片的12孔培养板,加入含10%FBS的1640培养基进行培养。采取免疫组化技术检测培养ICC c-kit抗体的表达,采取亚甲蓝活染标记培养ICC。2.取成年小鼠,制备含纵形肌的肌片。采取亚甲蓝活染标记ICC,观察ICC的形态、网络结构及与神经节的联系。3.原代培养ICC,分为对照组和NGF组。NGF组在经过12小时孵育后加入50 ng/ml的NGF。培养3天后,比较两组ICC的生长情况,观察数量和网络结构的变化。记录ICC的起搏电流,比较两组ICC起搏电流的幅度、频率等特点。记录ICC的外向整流性氯电流,探讨该电流的特点,并比较两组氯电流的幅度变化。结果1.培养3d后,在倒置显微镜下可见组织块形成细胞界限清楚、层次显著的细胞团。典型的ICC出现胞体呈三角形,核大、胞质少、胞体多突起、并有次级分支,细胞之间相互连接形成网络,相邻平滑肌细胞呈梭形。直接免疫荧光染色后,在共聚焦显微镜下可见ICC细胞c-Kit免疫荧光染色呈阳性,细胞间相互联系呈网络状。平滑肌细胞则为阴性。经亚甲蓝活染,外周ICC呈均匀深蓝色,镜下可见收缩运动。而神经细胞、平滑肌细胞在成活状态下均不着色。亚甲蓝和c-kit抗体的共染表明,两者具有同一性。2.空肠肠管亚甲蓝染色后,在解剖显微镜下可见ICC呈蓝色或紫色,相互间形成网络状结构。ICC沿神经节主干边缘分布,有少数细胞位于神经节的上方。3.免疫荧光的结果显示,与对照组相比,NGF组ICC的数量显著增加。50 ng/mlNGF组显著增加ICC量85%(均n=6)。亚甲蓝标记也呈相似结果。NGF组ICC的突起增加并连接呈致密网络状。在传统的全细胞膜片钳方式下,可记录到节律性的内向电流。NGF组内向电流体现为节律性强,波幅整齐,波形总体一致,起搏电流的幅度显著增加(179.3±29 pA,n=6)。两组内向电流的频率无显著差别。两组ICC都可以记录到外向整流性氯电流。NGF组氯电流幅度显著增加(850±140 pA,n=10),且出现显著的内向尾电流。结论1.我们采取组织块培养法成功培养了ICC,并用免疫荧光技术和亚甲蓝染色进行了鉴定。亚甲蓝染色是标记ICC的一个很好的策略。我们在组织水平对ICC进行亚甲蓝标记,有助于对ICC进行定位。2.NGF能推动原代培养ICC的增殖,并使网络结构更致密。3.NGF能增加原代培养ICC的起搏电流幅度。外向整流性氯电流为ICC起搏电流的主要成分,NGF能增加氯电流的幅度。本课题的结果有助于进一步探明胃肠动力障碍性疾病的发病机制,并其为治疗提供新的方向。关键词：胃肠动力性疾病论文cajal间质细胞论文c-kit论文神经生长因子论文亚甲蓝论文起搏电流论文氯电流论文
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摘要6-9
Abstract9-13
引言13-15
第一部分 Cajal间质细胞的原代培养及鉴定15-29
实验一 ICC的原代培养及鉴定16-20
实验二、ICC的原位形态20-29
第二部分 神经生长因子对原代培养Cajal间质细胞生长发育的 调节作用29-38
材料30-31
策略31-32
结果32-33
讨论33-35
附图35-38
第三部分 神经生长因子对原代培养Cajal间质细胞起搏电流的 调节作用38-54
材料39-41
策略41-45
结果45-46
讨论46-49
附图49-54
结论54-55