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摘要：目的：视神经脊髓炎(Neuromyeptis optica, NMO)，是一种主要侵犯视神经和脊髓的中枢神经系统炎性脱髓鞘性疾病。多年来医学界对NMO是多发性硬化（Multiple Sclerosis，MS）的一种亚型还是一种独立疾病一直有着争议。自以2004年Lennon等发现NMO患者血清中有着一种特异性自身抗体即NMO-IgG，其靶抗原就是水通道蛋白4（AQP4）以来，越来越多的证据表明AQP4抗体不仅是NMO区别MS的特异标志物，而且在NMO发病机制中发挥重要的作用，NMO是一种抗体介导的体液免疫性疾病。在临床上AQP4抗体诊断NMO的敏感性和特异性分别达73%和91%，且NMO复发时血AQP4抗体滴度增高，利用免疫抑制剂减少复发的同时也降低AQP4抗体滴度；病理探讨表明NMO新鲜病灶中广泛缺乏星形胶质细胞和AQP4染色；体外探讨也证实AQP4抗体和星形胶质细胞特异性的结合导致AQP4内陷，增加血脑屏障的通透性，损害钠依赖性谷氨酸传递，产生补体依赖性细胞毒性。但这些体外探讨多为纯星形胶质细胞培养或AQP4转染细胞培养，AQP4抗体对混合细胞培养中星形胶质细胞和神经元的毒性作用尚无探讨。另外临床探讨已经证实小剂量强的松口服能减少NMO的复发，提示肾上腺皮质激素可能通过免疫抑制作用、抗炎、减轻细胞水肿等发挥其对NMO的治疗作用。故本探讨通过大鼠皮层原代细胞培养，首先观察不同滴度的NMO患者AQP4抗体阳性血清对大鼠皮层神经细胞的毒性作用；其次探讨甲泼尼龙对AQP4抗体诱导的神经毒性是否有保护作用。策略：1原代培养3天的新生Wistar大鼠大脑皮层神经细胞，分别加入正常对照血清、NMO患者AQP4抗体滴度分别为1:10、1:320、1:1000的血清，培养6小时后利用细胞免疫荧光染色法观察各组星形胶质细胞和神经元的形态学及数量变化。2原代培养3天的新生Wistar大鼠大脑皮层神经细胞，随机分为4组：对照组、甲泼尼龙组（0.8umol）、1:1000血清组、甲泼尼龙（0.8umol）+1:1000血清组，分别加入对应的血清或/和甲泼尼龙，培养6小时后利用细胞免疫荧光染色法观察各组星形胶质细胞和神经元的形态学及数量变化。结果：1荧光显微镜下形态学观察，对照组细胞体外形清晰，突起粗壮；加入AQP4抗体阳性血清6h后大鼠大脑皮层星形胶质细胞均可见肿胀，突起减少、缩短及断裂；神经元细胞也出现突起减少、断裂、长度不完整等体现。单独甲波尼龙处理组并不引起显著的星形胶质细胞和神经元形态学变化，而甲波尼龙预处理组能显著减少这种形态学转变。2原代培养的大鼠大脑皮层细胞暴露于不同滴度的AQP4抗体阳性血清6h，结果发现对照组、1:10、1:320和1:1000滴度血清处理组星形胶质细胞数目分别为52.22±3.75%、45.83±4.82%、35.77±5.91%和24.68±3.40%；与对照组相比，其余三组细胞数量均有不同程度的减少，单因素方差浅析显示各组之间差别有统计学作用（F值为48.49，P均0.05)。神经元数目分别为44.93±2.39%、39.00±4.33%、32.21±2.67%和23.35±2.65%；与对照组相比，其余三组细胞数量均有不同程度的减少，单因素方差浅析显示各组之间差别有统计学作用（F值为71.41，P均0.05)。3原代培养的大鼠大脑皮层细胞用0.8umol甲波尼龙预处理4h后，再加入1:1000滴度的AQP4抗体阳性血清，结果发现甲泼尼龙+1:1000血清组的星形胶质细胞和神经元数目(分别为44.52±3.71%和42.11±5.94%)较1:1000血清组（分别为24.68±3.40%和23.35±2.65%）显著增加，差别有统计学作用（P均0.05）。同时我们也发现单独甲波尼龙预处理会导致星形胶质细胞的减少(分别为43.29±3.80%和52.22±3.75%)，差别有统计学作用（P=0.00），而对神经元数目无显著影响(分别为43.10±5.56%和44.93±2.39%，P=0.42)。结论：1在体外大鼠大脑原代皮层细胞培养中，AQP4抗体阳性血清对星形胶质细胞和神经元有滴度依赖性的细胞毒性作用。2甲泼尼龙预处理可以减轻AQP4抗体阳性血清诱导的大鼠皮层星形胶质细胞和神经元的细胞毒性。3本探讨结果支持AQP4抗体涉及NMO的发病机制，也为临床测定AQP4抗体及激素治疗NMO提供了论述证据。关键词：视神经脊髓炎论文水通道蛋白4抗体论文原代细胞培养论文星形胶质细胞论文神经元论文甲泼尼龙论文
摘要4-7
ABSTRACT7-10
引言10-11
第一部分 水通道蛋白 4 抗体阳性血清对原代培养鼠皮层细胞的毒性作用11-21
前言11-12
材料与策略12-15
结果15-16
附图16-17
附表17-18
讨论18-20
小结20-21
第二部分 甲泼尼龙对水通道蛋白 4 抗体诱导的大鼠皮层细胞毒性的保护作用21-29
前言21-22
材料与策略22-23
结果23-25
附图25-26
附表26-27
讨论27-28
小结28-29