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摘要：目的建立专属、灵敏的高效液相色谱-串联质谱(Hplc-MS/MS)法测定人血浆中比伐卢定和人尿液中二甲双胍和罗格列酮的药物浓度,并探讨其在人体内的药物动力学特点。策略(1)测定人血浆中比伐卢定的浓度：①样品处理策略：向0.20mL血浆中分别加入50μL甲醇,50μL内标溶液(2.166μg/mL那法瑞林溶液),涡旋30s混匀；加600μL甲醇,涡旋30s混匀；离心10min(13000rpm),取上清液40℃氮气下吹干,残渣加入200μL乙腈：水(20：80,v/v),涡旋30s混匀,取5μL进样浅析。②质谱浅析：比伐卢定和内标那法瑞林在正离子检测方式下,采取电喷雾电离源(ESI源),主要生成[M+H]+准分子离子,分别为m/z1091.0和m/z662.2。选择性对准分子离子[M+H]+进行产物离子全扫描浅析,获得比伐卢定的主要碎片为m/z650.3,响应较强,比较稳定且背景噪音低,因而被选作多反应监测(MRM)定量的产物离子,用于定量浅析。那法瑞林生成的主要碎片离子为m/z328.7,将m/z328.7作为定量浅析时监测的产物离子。③色谱条件为：本试验选定的色谱条件为：色谱柱：Zorbax Ecppse C18柱(50mm×2.1mm I.D,3.5μm,美国安捷伦公司)；流动相：乙腈：0.2%甲酸=20：80(v/v)；流速：0.35mL/min；柱温：40℃；进样量：5μL。④受试者的选择：“申请药物临床试验报告、试验案例、健康志愿者知情同意书”经药品临床探讨基地医学委员会批准。选择健康志愿受试者30名,男女各半,年龄20～27岁,体重42～70kg,签署知情同意书,于试验前在医院接受全面的体格检查,对肝、肾功能进行化验测定,并进行心电图检查,正常者方可入选。受试者无既往病史,平时很少服药,不嗜烟酒,试验前14天内未用任何药物。临床试验在医院进行,采血期间禁烟酒、咖啡因类饮料,避开剧烈运动。⑤给药案例及样品采集：30名受试者按性别和登记顺序号分层随机分成低、中、高三组,每组各10人(男女各半),晚上统一进清淡饮食,于试验前一天晚8：00开始禁食,次日早上统一清淡饮食后,低、中、高剂量组受试者分别静脉推注0.25mg/kg、0.5mg/kg、1.0mg/kg比伐卢定注射液,服药后2h内不得饮水,不得卧下,服药后2h可饮水,4h后统一进标准餐(低脂肪饮食)。分别于注射前(0h)和注射后0.083、0.167、0.25、0.5、0.75、1、1.5、2、3、4、5h肘静脉采血4mL,采集的血样置于肝素化的试管中,3000rpm离心10min,分离血浆置-70℃储藏,用于血药浓度检测。⑥血浆样品浅析：未知血浆样品的测定按“血浆样品的浅析策略”项下操作,每天建立一条标准曲线,同时浅析低、中、高(双样本)的质控样品,并以同批的标准曲线计算各时间点样品中比伐卢定浓度和质控样品的浓度,由QC样品的结果决定当日数据的取舍,QC样品的相对偏差应在±15%范围之内。⑦数据处理：将各受试者不同时间样品的血药浓度数据及平均值与标准差列表并作图；然后分别对每个受试者的血药浓度数据进行处理,进行有关药代动力学参数求算,并求出参数的平均值和标准差。Tmax.Cmax采取实测值；AUC0-t用梯形法计算；AUCO-∞=AUC0-t+Ct/ke(ke是末端消除速率常数)；t1/2按t1/2=0.693/ke求出；ke用对数血药浓度—时间曲线末端直线部分的斜率求得。(2)测定人尿液中二甲双胍和罗格列酮浓度：①样品处理策略：向0.20mL待测尿液中分别加入50μL甲醇,50pL水,50μL内标溶液(2.66μg/mL苯乙双胍水溶液),涡旋30s混匀；加400μL0.1%甲酸的乙腈溶液,涡旋30s混匀；离心15min(13000rpm),取上清液700μL加入水600μL,涡旋30s混匀,取5μL进样浅析。②质谱浅析：二甲双胍、罗格列酮和内标苯乙双胍在正离子检测方式下,采取ESI源,主要生成[M+H]+准分子离子,分别为m/z130.1、m/z358.2和m/z206.3。选择性对准分子离子[M+H]+进行产物离子全扫描浅析,获得二甲双胍和罗格列酮的主要碎片为m/z60.1和m/z134.9,响应较强,比较稳定且背景噪音低,因而被选作MRM定量的产物离子,用于定量浅析。苯乙双胍生成的主要碎片离子为m/z59.9,将m/z59.9作为定量浅析时监测的产物离子。③色谱条件为：色谱柱：Zorbax Ecppse C18柱(50mm×2.1mm I.D,3.5μm,美国安捷伦公司)；流动相：乙腈：0.1%甲酸+10mmol/L醋酸铵水溶液=20：80(v/v)；流速：0.25mL/min；柱温：室温；进样量：5μL。④受试者的选择：“申请药物临床试验报告、试验案例、健康志愿者知情同意书”经药品临床探讨基地医学委员会批准。选择健康志愿受试者10名,男女各半,年龄20～27岁,体重42-70kg,签署知情同意书。于试验前在医院接受全面的体格检查,对肝、’肾功能进行化验测定,并进行心电图检查,正常者方可入选。受试者无既往病史,平时很少服药,不嗜烟酒,试验前14天内未用任何药物。临床试验在医院进行,采血期间禁烟酒、咖啡因类饮料,避开剧烈运动。⑤给药案例及样品采集与处理：10名受试者(男女各半),晚上统一清淡饮食,于试验前一天晚8：00开始禁食,试验当日早晨6：00空腹站立位口服罗格列酮盐酸二甲双胍片(含二甲双胍500mg和罗格列酮2mg,200mL温开水送服),服药后2h内不得饮水,不得卧下,服药后2h可饮水,4h后统一进标准餐(低脂肪饮食)。给药后0-2、2-4、4-6、6-8、8-12、12-24h的尿液,每时间段尿液充分混合后量取尿液总体积,并取5mL尿液存于-20℃冰箱中冷冻保存,用于尿药浓度检测。⑥尿液样品浅析：未知尿液样品的测定按“尿液样品的浅析策略”项下操作,每天建立一条标准曲线,同时浅析低、中、高(双样本)的质控样品,并以同批的标准曲线计算各时间点样品中二甲双胍和罗格列酮浓度和质控样品的浓度,由QC样品的结果决定当日数据的取舍,QC样品的相对偏差应在±15%范围之内。⑦将各受试者不同时间的尿样中药物浓度数据及平均值与标准差列表并作图；然后分别对每个受试者的尿药浓度数据进行处理,进行有关药代动力学参数求算,并求出参数的平均值和标准差。t1/2按t1/2=0.693/ke求出；ke用对数尿药浓度—时间曲线末端直线部分的斜率求得。结果血浆中比伐卢定的线性范围分别为1.006-2011ng/mL,定量下限为1.006ng/mL。日内精密度为3.2%～5.8%,日间精密度分别为6.0%～9.5%,准确度分别为2.7%～7.8%。30名健康受试者单剂量注射低、中、高三个剂量比伐卢定注射液后,血浆中的比伐卢定Tmax分别为0.091±0.021h,0.1±0.035h,0.1±0.053h：Cmax分别为2016.5±535.97ng/mL,3788.8±797.7ng/mL,6759±1959.4ng/mL；t1/2分别为0.66±0.14h,0.55±0.30h,0.75±0.41h；用梯形法计算, AUC0-t分别为909.0±152.3μg·h/mL,1755.8±235.5μg·h/mL,3135.4±350.9μg·h/mL；AUC0-∞分别为955.7±146.9μg·h/mL,1798.1±248.7μg·h/mL,3199.3±378.4μg·h/mL。尿液中的二甲双胍和罗格列酮的线性范围为202-20200ng/ml和1.054-263.5ng/mL,定量下限分别为202.0ng/mL和1.054ng/mL。日内精密度分别为3.7%～5.8%和4.7%～5.2%,日间精密度分别为1.9%～14.7%和8.3%～14.7%,准确度分别为-5.7%～0%和-4.8%～3.1%。10名受试者单剂量口服500mg二甲双胍和2mg罗格列酮后,在尿液中未检测到罗格列酮原型药物,二甲双胍主要药动学参数,t1/2为3.14±0.5h,尿排率为31.846±18.517%。结果表明,Hplc-MS/MS法测定人血浆中比伐卢定和尿液中的二甲双胍及罗格列酮已取得令人满意的结果。首先测定血浆中比伐卢定和尿液中二甲双胍及罗格列酮,每一样品的测试时间仅需4.5min和3.0min,使得样品通量大大提升,每日能浅析250～300个生物样品；其次MRM技术能够同时检测母离子和具有特点反应的子离子；母离子被碰撞,特定子离子被选择监测,显著降低了背景噪音,因而具有高度的专属性和灵敏度。此外实验中对样品前处理为乙腈蛋白沉淀,该策略简便,快捷,经济符合药代动力学高通量的需求。而且防止了内源性物质在色谱柱上的蓄积,延长了色谱柱利用寿命。结论本论文所建立的Hplc-MS/MS浅析策略,具有专属、灵敏、快速的优点,适于人血浆中比伐卢定及尿液中二甲双胍和罗格列酮的浓度测定,并成功运用于药物动力学探讨。关键词：高效液相色谱-串联质谱法论文比伐卢定论文二甲双胍论文罗格列酮论文药代动力学论文
摘要3-8
ABSTRACT8-14
第一章 前言14-20
1.1 临床药理学介绍14-15
1.2 常见的体内药物浅析策略15-17
1.3 抗凝血药物比伐卢定体内药物浅析策略的探讨进展17
1.4 口服降血糖药二甲双狐和罗格列酮体内药物浅析策略的探讨进17-18
1.5 本论文探讨的主要的内容18-20
第二章 人血浆中比伐卢定HPLC-MS/MS法测定及药动学探讨20-42
2.1 药品与试剂20-21
2.2 溶液配制21
2.3 仪器与设备21
2.4 比伐卢定血浆样品浅析策略的建立21-22
2.5 结果22-26
2.6 讨论26-42
第三章 人尿液中二甲双胍和罗格列酮的HPLC-MS/MS法测定及药动学探讨42-64
3.1 药品与试剂42-43
3.2 溶液配制43-44
3.3 仪器与设备44
3.4 二甲双胍和罗格列酮尿液样品浅析策略的建立44-45
3.5 结果45-49
3.6 讨论49-64
第四章 结论64-66