您的位置: turnitin查重官网> 医药学 >> 药剂学 >干细胞基于EST模型全氟烷基化合物致心肌发育毒性作用与其定量蛋白质组学

干细胞基于EST模型全氟烷基化合物致心肌发育毒性作用与其定量蛋白质组学

收藏本文 2024-03-07 点赞:7736 浏览:19012 作者:网友投稿原创标记本站原创

摘要:胚胎干细胞测试(embryonic stem cell test. EST)系统以胚胎干细胞(embryonic stem cell, ES cell)分化为心肌细胞模型为基础,是欧洲代替策略验证中心(the European Center for the Vapdation of Alternative Methods, ECVAM)提出的作为体外筛选和评价受试物(包括药物或环境中化合物等)可能具有的发育毒性手段。该系统能基本模拟乃至重现体内心肌分化和发育复杂全程,富含大量心肌发育依赖性生物信息,与体内毒性实验相比,具有对药物作用反应迅速、干扰因素少、敏感性高等优点。全氟烷基化合物(Polyfluorinated Alkyl Substances, PFAS)被广泛运用于工业生产和人类消费,包括全氟辛烷磺酸(Perfluorooctane Sulfonate, PFOS),全氟辛酸(Perfluorooctanoic Acid, PFOA),全氟丁基磺酸(Perfluorobutane Sulfonate, PFBS)等。该类化合物大量利用致使其以各种途径进入全球范围内各种环境介质如水体、土壤、大气中,并通过食物链传递放大生物效应,目前在人体以及许多动物组织中均发现浓度较高PFOS和PFOA有着。这类化合物在自然环境和生物体内具不分解性和很高的生物积累能力,其所造成的全球性生态污染已成事实,这是直接联系到人类健康的重要不足。已有文献报道PFOS具有发育毒性、生殖毒性、心血管毒性、神经毒性等多重毒性效应,被认为是一类具有全身多脏器毒性化合物。虽然探讨者已经掌握了一些关于PFOS发育毒理学探讨资料,但还处于初始阶段,且多限于动物实验。PFOS引起的发育毒性作用机制和敏感指标还远未完全清楚。氨基酸进行稳定同位素标记(Stable Isotope Labepng with Amino Acidsin Cell Cultures, SILAC)是近年来进展起来的比较蛋白组学新策略,可以对低丰度蛋白质直接捕获和快速定性、定量鉴定浅析,快速找出重要功能蛋白质。目前尚未见利用EST系统预测全氟烷基化合物对心肌发育毒性作用探讨报道,也未见利用SILAC标记定量蛋白质组学技术探讨该类化合物毒性作用机制,亟待深入探讨加以论证。基于上面陈述的背景,本学位论文主要利用EST模型以细胞毒性、分化抑制、基因蛋白表达不同水平系统论证全氟烷基系列化合物PFOS、PFOA和PFBS心肌发育毒性作用强弱等级及构效联系。为进一步重点考察PFOS对心肌发育毒性作用的具体分子机制,我们采取SILAC标记的蛋白组学策略定量探讨PFOS干预ES细胞定向分化心肌细胞前后差别表达蛋白图谱。采取GO分类策略探讨差别蛋白的细胞位置、基因参与的生物历程、发挥的分子功能,通过Pathway浅析PFOS对不同通路的影响,通过Network浅析差别基因的网络互作联系,并采取Western Blot法对差别蛋白予以验证。探讨结果将有利于揭示PFOS引起心肌发育毒性作用的早期分子事件和毒性敏感指标。同时有利于将EST作为一种有效的毒性评价系统在化合物成药性或环境毒物对心肌毒性预测性评估中的推广运用。目的:利用EST模型以细胞毒性、分化抑制、基因蛋白表达不同水平评价全氟烷基化合物PFOS、PFOA和PFBS对小鼠胚胎干(Mouse Embryonic Stem, mES)细胞定向分化为心肌细胞的发育毒性作用,浅析该类化合物致心肌发育毒性的构效联系。并利用SILAC标记的定量蛋白质组学探讨PFOS致心肌发育毒性作用机制。策略:利用经典的悬滴培养法建立EST模型,加入不同浓度的青霉素、DPH、5-FU以及全氟烷基化合物PFOS、PFOA和PFBS,检测受试物对mES定向心肌分化能力的影响获得产生50%mES细胞分化抑制作用的浓度ID50D3;采取MTT法检测受试物对ES细胞和3T3细胞的细胞毒性获得产生50%细胞毒性作用的浓度IC50D3和IC503T3,经发育毒性计算公式计算,并依据发育毒性判定标准评定受试物的发育毒性等级,并浅析全氟烷基化合物致心肌发育毒性构效联系。利用SILAC定量蛋白质组学技术考察PFOS干预ES细胞定向分化心肌细胞前后差别表达蛋白图谱,分别用含轻型稳定同位素(天然稳定同位素)和重型稳定同位素标记必需氨基酸的培养基,对mES分别进行培养,待细胞标记完全后(标记率90%以上),将经过轻、重型同位素标记的两组细胞进行悬滴、悬浮、贴壁培养,设定轻型同位素标记细胞为溶剂对照组,重型同位素标记细胞用PFOS处理。化合物处理10天后收集样本,分别提取蛋白等比例混合后经SDS-PAGE分离,酶解提取肽,进行质谱检测,通过质谱图上每对轻重稳定同位素峰比例可反映对应蛋白在PFOS作用后的表达变化。根据每个鉴定蛋白至少包含两段鉴定多肽,且溶剂对照组(DMSO)和实验组(PFOS)差别1.5以上的标准来筛选差别蛋白。用Gene Ontology annotations软件对差别蛋白进行功能分类,通过网络数据浅析以及文献查阅来确定差别蛋白的功能,揭示PFOS致心肌发育毒性部分作用靶标。基于蛋白组学的结果,选取了活性氧信号通路以及OCT4化方面与PFOS心肌发育毒性作用的相关性进行了探讨。主要利用Western Blot策略和RT-PCR策略进行重要蛋白的验证。通过DCF-DA检测PFOS作用后拟胚体EBs内ROS含量。结果:通过EST模型评价了青霉素(Penicilpn G)、苯妥英(Phenytoin, DPH、5-氟尿嘧啶(5-Fluorouracil,5-FU)心肌发育毒性,三者IC50D3依次为6981、246和0.36μM, IC503T3分别为6370、240和0.45μM, ID50D3分别为4626、99和0.31μM,心肌发育毒性等级分别为一级、二级、,结果与文献报道一致,该模型通过有效性验证,适用于全氟烷基化合物PFBS、PFOA和PFOS心肌发育毒性评价。受试化合物PFBS、PFOA和PFOS的IC50D3依次为4139、470和291μM, IC503T3分别为5980、484和435μM, ID50D3分别为808、223和40μM,心肌发育毒性等级分别为一级、二级、二级。三者心肌发育毒性强弱顺序为PFOSPFOAPFBS,且具有一定构效联系,即碳链越长心肌发育毒性越大,末端磺酰化心肌发育毒性大于未磺酰化。以形态上观察,PFOS作用ES细胞后,影响拟胚体(embryoid bodies, EBs)形态,浓度越大,EBs半径越小。RT-PCR检测结果显示,随着PFOS浓度增加,中胚层基因Brachury及心肌特异性基因a-MHC表达下降,且呈浓度依赖性。Western blot策略检测结果显示,PFOS使心肌特异性转录因子GATA4、MEF2C呈浓度依赖性表达下调。流式细胞术定量检测PFOS使表达心肌特异性蛋白a-actinin的心肌细胞数量呈浓度依赖性下调。SILAC标记蛋白质组学浅析结果显示,PFOS作用后与溶剂对照组比较,mES分化为心肌细胞蛋白质表达图谱有着显著差别。共筛选出176个差别蛋白,PFOS作用后67个蛋白上调和109个蛋白下调。对差别蛋白进行GO浅析显示,在分子功能方面有13个分类,在细胞定位方面有12个分类,在细胞生物学历程方面有10个分类。将差别蛋白对应基因进行KEGG通路浅析,共筛选到31个统计学上有显著作用的信号通路,主要涉及参与信号转导、脂代谢、能量代谢及酶代谢相关通路。在网络浅析图中,差别蛋白对应基因与基因组中其他基因的相互作用共涉及到118个蛋白1296个相互作用,其中与发育相关差别基因与其他基因的相互作用涉及32个蛋白469个相互作用。基于上面陈述的蛋白组学结果,选取了活性氧信号通路以及OCT4化方面探讨相关毒性作用机制。对差别蛋白Dnmt3b、Dnmt3a、SOD2、Hsp27、MYH10及其相关蛋白进行验证,PFOS作用后Dnmt3b、Dnmt3a蛋白表达呈下调走势,Dnmt3b在第3、5、6d均有显著下调,而Dnmt3a在第6d显著下调,而OCT4在第5、6d上调。PFOS使SOD2、Hsp27上调,SOD在第3、5d上调显著,Hsp27的磷酸化形式在全程均成上调走势,致使在心肌分化历程中ROS减少,导致ERK1/2. p38MAPK磷酸化降低,进而使下游GATA4、MEF2C. α-MHC, α-actinin、MYH10表达下调。结论:1.基于EST系统测得PFOS.PFOA. PFBS心肌发育毒性分别为二级、二级、一级,心肌发育毒性强弱顺序为PFOSPFOAPFBS,构效联系为碳链越长心肌发育毒性越大,末端磺酰化心肌发育毒性大于未磺酰化。2.通过SILAC标记的定量蛋白组学构建了PFOS对ES细胞定向分化为心肌细胞蛋白质差别表达图谱,通过质谱共鉴定出176个差别蛋白,其中67个蛋白上调和109个蛋白下调。差别蛋白涉及31个生化和信号通路,蛋白质相互作用网络图包含118个蛋白1296个相互作用。3. PFOS持续作用使清除活性氧相关蛋白SOD2、Hsp27表达增加,EBs中ROS含量降低,致使p38MAPK通路活化受阻,以而抑制心肌分化。另一方面,PFOS可使DNA转移酶下调,致使OCT4沉默受阻,以而抑制了ES细胞的分化启动进程。关键词:全氟烷基化合物论文PFOS论文胚胎干细胞论文SILAC标记蛋白质组学论文心肌细胞论文发育毒性论文

    致谢6-7

    摘要7-12

    Abstract12-18

    中英文/缩写词对照表18-19

    目次19-22

    引言22-26

    实验仪器与材料26-29

    1 仪器26

    2 主要实验试剂26-28

    3 实验动物及细胞株28-29

    实验策略29-40

    1 细胞培养29-32

    1.1 3T3细胞培养29

    1.2 MEF细胞培养29

    1.3 小鼠ES细胞的支持培养29

    1.4 胚胎干细胞测试系统对受试物的心肌发育毒性评价29-32

    1.5 受试物心肌发育毒性评价32

    2 SILAC法进行同位素氨基酸标记32

    2.1 ES细胞标记32

    2.2 分化细胞标记32

    3. 差别蛋白组学浅析32-37

    3.1 样本平行性测试及标记率检测32-34

    3.2 差别蛋白检测34-37

    4 逆转录-聚合酶链反应37-38

    4.1 收集样本37

    4.2 Trizol法提取细胞总mRNA37

    4.3 逆转录37

    4.4 PCR扩增37-38

    5 Western-blot检测蛋白表达38-39

    6 流式细胞术定量检测39

    7 荧光显微镜检测EBs内ROS水平39

    8 数据浅析39-40

    第一部分 基于EST模型的全氟烷基化合物致心肌发育毒性作用探讨40-48

    1、实验结果40-45

    1.1 EST系统有效性验证40-42

    1.2 利用EST模型检测全氟烷基化合物的心肌发育毒性42-43

    1.3 PFOS对ES细胞向心肌分化历程中形态的影响43

    1.4 RT-PCR检测PFOS对ES细胞向心肌分化历程中基因表达情况43

    1.5 流式细胞术、Western blot策略检测心肌特异性蛋白表达43-45

    2 讨论45-47

    3 小结47-48

    第二部分 PFOS心肌发育毒性作用的差别蛋白组学探讨48-84

    1 实验结果48-78

    1.1 SILAC差别蛋白组学48-59

    1.2 Gene Ontology浅析59-67

    1.3 表达谱KEGG通路浅析67-69

    1.4 Network浅析69-74

    1.5 PFOS心肌发育毒性相关机制探讨74-78

    2 讨论78-82

    3 小结82-84

    总结84-85

    论新点85-86

copyright 2003-2024 Copyright©2020 Powered by 网络信息技术有限公司 备案号: 粤2017400971号