您的位置: turnitin查重官网> 医学 >> 医学检验 >试议耐药卵巢癌铂类耐药标记蛋白AnnexinA3化学发光试剂盒研制与其在临床运用中

试议耐药卵巢癌铂类耐药标记蛋白AnnexinA3化学发光试剂盒研制与其在临床运用中

收藏本文 2024-03-06 点赞:32478 浏览:139601 作者:网友投稿原创标记本站原创

摘要:探讨背景及目的卵巢癌是死亡率居首位的女性生殖系统恶性肿瘤,肿瘤细胞对化疗药物产生耐药性是临床治疗的主要障碍。运用铂类耐药标记蛋白,早期发现肿瘤耐药,有助于临床及时调整化疗案例,改善患者预后。本课题组前期运用比较蛋白质组学技术,发现并证实了一种卵巢癌铂类耐药标记蛋白膜联蛋白A3(Annexin A3),该蛋白能够以细胞内囊泡形成、转运、外泌体的形式外泌,在细胞培养液上清和人外周血中均可检测到不同水平的表达,AnnexinA3有望成为一种铂类耐药血清学标记物运用于临床。然而,在扩大样本量进行临床检测的探讨中发现,本课题组所运用的目前市场上唯一可提供的ELISA试剂盒有着敏感度低、重复性差等突出不足,造成实验数据的准确性欠佳。由此,研制一种能高通量、稳定检测人外周血Annexin A3蛋白表达水平的免疫浅析试剂盒成为本课题深入探讨中亟待解决的关键不足。化学发光免疫浅析法(CLIA)是继放射免疫浅析法、酶免疫浅析法和荧光免疫浅析法之后进展起来的一种新的免疫学测定策略,该技术将高特异性的抗原抗体反应与高灵敏度的化学发光反应结合起来,具有灵敏度高、特异性强、重复性好、操作简便、浅析快速、无放射污染等优点,成为目前临床检测蛋白分子的主流策略。本实验在前期有关卵巢癌铂类耐药特异性标记蛋白Annexin A3工作的基础上进行深入探讨,旨在制备能够满足临床检测要求的Annexin A3蛋白化学发光试剂盒,并运用该试剂盒对不同女性人群外周血中的Annexin A3蛋白进行检测,以了解该蛋白在人外周血中的表达情况,初步确定其正常值范围,并探讨其作为血清学标志物对临床上卵巢癌患者铂类化疗耐药的预测价值。探讨策略1、筛选匹配高特异性的Annexin A3抗原及抗体对,制备检测人外周血.中AnnexinA3蛋白的化学发光免疫浅析试剂盒。购写市售的人Annexin A3重组蛋白及六种Annexin A3多克隆、单克隆抗体作为检测抗原和抗体,化学发光免疫浅析法检测不同组合的两种抗体与各浓度抗原反应的发光值,绘制标准曲线,计算线性拟合相联系数r及信噪比(最高浓度标准品与0值标准品发光值之比,S5/SO),r值越接近1、信噪比越大表明抗原抗体间的结合特异性越高,选择r值及信噪比最大的两种抗体作为制备试剂盒的捕获抗体和检测抗体。将人Annexin A3重组蛋白稀释成不同浓度作为标准品,将筛选出的捕获抗体包被在固相载体上,采取改良过碘酸钠法连接检测抗体和辣根过氧化物酶制备出酶标检测抗体,两种抗体与抗原形成双抗体夹心复合物,加入发光底物后,使该复合物发光,化学发光仪检测发光强度。交叉方阵滴定法确定捕获抗体与酶标检测抗体的最佳工作浓度,并分别采取一步法和两步法对反应方式进行优化,最终确立最佳检测系统,完成试剂盒的制备。2、对制备完成的Annexin A3化学发光试剂盒进行灵敏度、精密度和稀释线性的评价,确定检测工作范围,并与本课题组前期探讨中运用的目前市场上唯一可提供的Annexin A3酶联免疫吸附法(ELISA)检测试剂盒进行比较评价。平行测量20个零值标准品(S0),以其发光值(RLU)的平均值(Mean)加上两倍标准差(SD)所对应的浓度值求得本策略的灵敏度。精密度指测定结果的可重复性,评价指标为变异系数(coefficient of variation, CV),分别用1.6ng/mL和0.8ng/mL两种浓度的Annexin A3蛋白作为高、低值质控品,每个质控品平行做20孔,用不同批次的包被板重复测3次,计算单次检测(批内)和多次检测(批间)的CV值,CV(%)=标准差(SD)/均数(Mean)。将1份本课题组前期实验中用ELISA法测定为高值的血清样品(浓度为1.25ng/mL),按1:1、1:2、1:4、1:8、1:16、1:32、1:64进行倍比稀释后测定发光值,对稀释倍数及发光值进行线性拟合,计算相联系数r。将各浓度的标准品重复检测10次,根据每次的标准曲线求得相应浓度值,计算10次测量的均数及标准差,进而求出各浓度点的变异系数CV,以CV为纵坐标,浓度值为横坐标,绘制精密度曲线图,选用图异系数小于10%的浓度范围作为试剂盒的工作范围。取健康女性、卵巢良性肿瘤、上皮性卵巢癌患者的血清样本各20份,分别运用两种试剂盒进行检测,比较测定值的分布及对低值血样的区分情况。3、运用Annexin A3化学发光试剂盒高通量检测人外周血中Annexin A3蛋白的表达水平,确定其正常值范围,评估其作为卵巢癌铂类化疗耐药血清学标志物的可行性,同时与CA125比较在临床诊断卵巢癌耐药中的作用。连续收集2009年9月至2012年4月期间在北京协和医院体检的健康女性血清、以及住院手术治疗的卵巢良性和交界性肿瘤患者术前血清、上皮性卵巢癌患者治疗前血清,运用CLIA试剂盒检测Annexin A3蛋白在各组人群外周血中的浓度,初步建立其正常参考值范围。前瞻性连续收集卵巢癌患者治疗前、术后化疗前、化疗历程中以及化疗结束后的血清样本,并记录同期的CA125测定值。运用CLIA试剂盒检测Annexin A3的浓度,评估各临床病理因素、手术及化疗对Annexin A3表达水平的影响。对所有卵巢癌患者进行随访,根据目前对卵巢癌铂类耐药的定义判断患者的化疗结局,分为敏感组和耐药组,明确Annexin A3在两组患者不同治疗时点的动态变化及表达差别。与CA125进行相关性浅析,探讨各治疗时点的Annexin A3表达水平与铂类耐药的联系,通过诊断试验评估CA125及Annexin A3对铂类耐药的诊断或预测作用:制作受试者工作特点(ROC)曲线,计算曲线下面积(AUC)以及各浓度值对应的约登指数(又称正确诊断指数,等于敏感度与特异度之和减1),AUC=0.5表明无诊断价值,AUC在0.5~0.7时有较低准确性,在0.7~0.9时有一定准确性,在0.9以上有较高准确性,约登指数最大时表明以该对应浓度为界值进行诊断的准确性最高,由此选择该浓度值为最佳诊断界值,计算此时诊断的敏感度、特异度、准确度(总符合率)、检测阳性率、检测阴性率、阳性预测值及阴性预测值。通过COX风险回归模型及Kaplan-Meier存活浅析评估治疗前Annexin A3水平对患者无进展存活期的影响。探讨结果1、选用兔抗-Annexin A3多克隆抗作为捕获抗体,鼠抗-Annexin A3多克隆抗体作为检测抗体时,与各浓度Annexin A3抗原反应得到的标准曲线的相联系数r及信噪比均最大,分别为0.9982和19.56,故选择两者运用于试剂盒的制备。采取浓度为5μg/mL的捕获抗体包被固相载体,稀释度为1:250的酶标检测抗体进行检测时,与各浓度Annexin A3标准品反应得到的标准曲线的相联系数r及信噪比均最大,分别为0.9987和59.33,以而确定为最佳工作浓度。采取一步法和两步法检测时的相联系数均较好,分别为0.9983和0.9986,但一步法的信噪比略高于两步法(49.11vs45.57),结合操作的简便性,反应方式选择一步法。2、试剂盒的最低检测浓度即灵敏度为0.08ng/mL;批内精密度为5.92~8.63%,批间精密度为5.15~6.42%;高值血样的稀释度与发光值间呈良好的线性相关,相联系数r为0.9997;标准曲线在0.1~1.6ng/mL浓度之间的变异系数均小于10%,由此选定0.1~1.6ng/mL作为工作范围。两种试剂盒检测结果显示,ELISA试剂盒对60份血样的中位测值为0.36ng/mL (0.1~2.03ng/mL),其中80%(48/60)的血样测值低于标准曲线倡议的最低浓度(0.8ng/mL),30%(18/60)低于ELISA试剂盒说明书标明的最低检测浓度(0.2ng/mL); CLIA试剂盒对60份血样的中位测值为0.95ng/mL (0.04~2.77ng/mL),90%(54/60)的血样测值位于标准曲线范围内,其中2例低于试剂盒最低检测浓度(0.08ng/mL),4例高于标准曲线上限(1.6ng/mL),将该4份高值血清分别稀释2倍、4倍、8倍后进行复测,不同稀释倍数得到的最终测值间具有较好的一致性,变异系数均不到3%。CLIA试剂盒的操作步骤也较ELISA试剂盒简单,前者采取样本和酶标检测抗体同时加入的一步法检测方式,反应时间仅需2小时,而后者则需将样本和酶标检测抗体分三步加入,反应时间长达4.5小时。3、共纳入符合标准的健康女性113例,卵巢良性肿瘤患者70例,卵巢交界性肿瘤患者14例,上皮性卵巢癌患者96例。四组人群外周血Annexin A3的中位浓度分别为0.75ng/mL (0.15~1.54ng/mL)、0.66ng/mL (0.04~1.79ng/mL)、0.65ng/mL (0.14~3.29ng/mL)以及1.12ng/mL (0.20~6.18ng/mL);卵巢癌患者治疗前Annexin A3水平显著高于健康女性及卵巢良性肿瘤患者(P值均为0.000),健康女性与卵巢良性肿瘤患者相比无统计学差别(P=0.322),卵巢交界性肿瘤患者与其余三组人群相比均无统计学差别(P值分别为0.144、0.132、0.236)。Annexin A3在113例健康女性外周血中的表达水平呈近似正态分布(Z=0.723,P=0.6730.05),采取正态分布法确定参考值范围,正常值上限为Mean+1.96SD=1.45ng/mL卵巢癌患者治疗前Annexin A3水平与年龄、组织学类型、组织学分级、手术病理分期、淋巴结转移均无关(P值分别为0.985、0.631、0.347、0.441、0.480);术前及术后化疗前Annexin A3的中位浓度分别为1.11ng/mL (0.43~4.55ng/mL)、1.23ng/mL (0.4~4.32ng/mL),相比无统计学差别(P=0.226);化疗前、化疗中、化疗后Annexin A3的中位浓度分别为1.15ng/mL (0.42~6.18ng/mL)、0.23ng/mL (0.02~3.00ng/mL)以及0.24ng/mL (0.03~1.82ng/mL),化疗中和化疗后较化疗前显著降低(P值均为0.000),化疗中与化疗后相比无统计学差别(P=0.487)。截至2012年4月30日随访结束,96例卵巢癌患者的中位随访时间为10.73个月(2.23-32.17个月),共有56例可明确判断铂类耐药性结局,其中铂类敏感患者41例(占73.21%),耐药患者15例(占26.79%);共有21例患者出现疾病进展,3例失访,3例仍在进行先期化疗,尚未手术。敏感组患者治疗前、化疗中、化疗后的Annexin A3中位浓度分别0.80ng/mL (0.20~2.43ng/mL).0.31ng/mL(0.02~0.84ng/mL)、0.22ng/mL(0.06~0.75ng/mL),耐药组患者分别为2.21ng/mL (0.5~6.18ng/mL)、0.16ng/mL (0.04~0.76ng/mL)、0.24ng/mL (0.03~1.79ng/mL),两组患者化疗中及化疗后的Annexin A3水平均较化疗前显著降低(P值均为0.000),化疗中与化疗后相比无统计学差别(P值分别为0.605、0.296);组间比较显示,耐药组患者治疗前Annexin A3水平显著高于敏感组(P=0.012),而化疗中与化疗后两组的Annexin A3水平无显著差别(P值分别为0.937、0.624)。敏感及耐药患者治疗前CA125的平均浓度分别为(1096.51±1689.91)U/mL、(1896.48±2162.88)U/mL,两组比较无统计学差别(P=0.271),而耐药组患者化疗中CA125的表达水平显著高于敏感组(P=0.003),平均浓度分别为(16.52±12.47)U/mL、(198.89±527.32)U/mL,经相关性浅析,治疗前、化疗中及化疗后AnnexinA3的表达水平均与CA125无关(P值分别为0.384、0.594、0.883)。治疗前CA125对铂类耐药无诊断作用,ROC曲线下面积AUC为0.597(P=0.271);化疗中CA125诊断铂类耐药的AUC为0.755(P=0.014),最佳界值点为24.60U/mL,此时诊断铂类耐药的敏感度为60.00%,特异度为90.24%,准确度为82.14%,检测阳性率为40.00%,检测阴性率为9.76%,阳性预测值为69.23%,阴性预测值为86.01%。以正常参考值上限1.45ng/mL为界对治疗前患者进行分组,高水平组发生铂类耐药的比率显著高于低水平组(55.56%vs13.16%,P=0.001),Logistic回归浅析显示,治疗前Annexin A3水平是发生铂类耐药的危险因素之一(P=0.004,OR=9.241),高水平组发生铂类耐药的风险是低水平组的9.241倍。诊断试验结果显示,治疗前Annexin A3诊断铂类耐药的AUC为0.744(P=0.006),最佳界值点为1.645ng/mL此时治疗前Annexin A3预测铂类耐药的敏感度为66.70%,特异度为82.93%,准确度为78.57%,检测阳性率为17.07%,检测阴性率为33.30%,阳性预测值为58.82%,阴性预测值为87.18%。COX风险回归模型浅析显示,治疗前Annexin A3水平是影响患者疾病进展的独立危险因素(P=0.001,RR=9.863),高水平组发生疾病进展的风险是低水平组的9.863倍,Kaplan-Meier存活浅析显示,两组的中位PFS分别为27.60个月(2.23-32.17个月)和12.77个月(4.90-25.80个月),高水平组的PFS显著短于低水平组(P=0.001)。结论1、本探讨以市售的六种Annexin A3多克隆、单克隆抗体中筛选出与人Annexin A3重组蛋白特异性结合最好的两种作为制备化学发光试剂盒的捕获抗体和检测抗体,首次成功制备出人Annexin A3蛋白化学发光定量检测试剂盒。2、本探讨制备的Annexin A3化学发光试剂盒具有较高的灵敏度,良好的重复性和稀释线性,操作方便、浅析迅速,显著优于市售ELISA试剂盒,能够满足临床检测的要求,但该试剂盒还有着检测上限值偏低、高值血清样本需重新稀释后复测的缺点,需进一步改善以增加检测的线性范围。3、运用本探讨研制的化学发光试剂盒可以检测到不同人群外周血中Annexin A3蛋白的差别表达,卵巢癌患者治疗前Annexin A3水平显著高于健康女性及卵巢良性肿瘤患者,初步确定女性外周血Annexin A3的正常参考值上限。前瞻性观察56例可随诊结局的卵巢上皮癌患者,治疗前耐药组Annexin A3的的测定值显著高于敏感组,化疗期间耐药组CA125的的测定值显著高于敏感组,提示卵巢癌患者治疗前外周血Annexin A3的测定值对于临床出现铂类耐药具有一定的预测作用,化疗期间CA125测定值对于临床出现铂类耐药具有一定的诊断作用。此外,治疗前Annexin A3水平还是影响患者疾病进展的独立危险因素,是判断预后的重要指标。关键词:膜联蛋白A3论文卵巢癌论文铂类耐药论文化学发光论文免疫浅析论文

    缩略词表4-5

    中文摘要5-10

    ABSTRACT10-17

    前言17-20

    第一部分 Annexin A3化学发光试剂盒的制备20-28

    材料与策略20-25

    结果25-26

    讨论26-28

    第二部分 Annexin A3化学发光试剂盒的评价28-36

    材料与策略28-31

    结果31-34

    讨论34-36

    第三部分 人外周血Annexin A3表达水平的临床作用评估36-57

    材料与策略36-41

    结果41-54

    讨论54-57

copyright 2003-2024 Copyright©2020 Powered by 网络信息技术有限公司 备案号: 粤2017400971号