您的位置: turnitin查重官网> 医学 >> 医学检验 >谈谈应激氧化应激在LPS诱导小鼠肺巨噬细胞自噬中作用机制科技

谈谈应激氧化应激在LPS诱导小鼠肺巨噬细胞自噬中作用机制科技

收藏本文 2024-01-04 点赞:16167 浏览:63463 作者:网友投稿原创标记本站原创

摘要:目的:目前国内外对氧化应激在脂多糖(Lippolysaccride,LPS)与自噬之间的相互作用及机制探讨较少,本实验通过观察LPS诱导对小鼠肺巨噬细胞(Ana-1)损伤的影响,并以氧化应激Ana-1细胞DNA损伤和自噬角度探讨氧化应激对LPS诱导对Ana-1细胞自噬的作用机制及其相关的分子机制。策略:1. LPS刺激Ana-1细胞模型的建立及氧化应激下LPS诱导Ana-1细胞损伤模型的建立。LPS作用于Ana-1细胞, ROS荧光探针-DHE检测Ana-1细胞内活性氧族物质(ReactiveOxygen Species,ROS)的表达情况,总SOD活性检测试剂盒(WST法)检测Ana-1细胞总超氧化物歧化酶(Superoxide Diutase, SOD)的表达情况,彗星实验试剂盒检测Ana-1细胞DNA损伤的情况。氧化应激作用于LPS诱导下的Ana-1细胞,ROS荧光探针-DHE检测Ana-1细胞ROS的表达情况,总SOD活性检测试剂盒(WST法)检测Ana-1细胞总SOD的表达情况,通过彗星实验试剂盒检测Ana-1细胞DNA损伤的情况,比较LPS作用于Ana-1细胞与氧化应激下LPS诱导的Ana-1细胞的指标变化情况。2.LPS作用下的Ana-1细胞自噬现象和氧化应激下LPS诱导的Ana-1细胞自噬现象。LPS浓度为1ug/ml刺激Ana-1细胞4h(LPS处理组),逆转录聚合酶链反应(RT-PC R)法检测自噬相关因子LC3-Ⅱ的mRNA表达水平变化,脂质体Lipofectamine2000转染质粒GFP-LC3(green fluorescent protein-microtubule associated protein pghtchain3,绿色荧光蛋白-微管相关蛋白1轻链3)和质粒RFP-LC3(Redfluorescent protein-microtubule associated protein pght chain3,红色荧光蛋白-微管相关蛋白1轻链3)观察LPS作用下的Ana-1细胞的自噬现象,免疫蛋白印记(Western Blot)法检测自噬基因BECN1蛋白和LC3Ⅰ/Ⅱ蛋白的表达。氧化应激下LPS诱导的Ana-1细胞(LPS+H_2O_2处理组,外源性H_2O_2浓度为12.5uM刺激Ana-1细胞2h后,再加入LPS浓度为1ug/ml刺激Ana-1细胞4h),RT-PCR法检测自噬相关因子LC3-Ⅱ的mRNA表达水平变化,脂质体Lipofectamine2000转染质粒GFP-LC3和质粒RFP-LC3观察自噬现象,Western Blot法检测自噬基因BECN1蛋白和LC3Ⅰ/Ⅱ蛋白表达。3.维生素C抗氧化应激损伤处理后(维生素C浓度为2000ug/ml,刺激1h后加入浓度为12.5uM的外源性H_2O_2,刺激Ana-1细胞2h后,再加入浓度为1ug/ml的LPS刺激Ana-1细胞4h)观察Ana-1细胞的自噬现象以及Western Blot法检测自噬基因LC3Ⅰ/Ⅱ蛋白表达。4.对照组用PBS进行刺激。比较对照组、LPS处理组和LPS+H_2O_2处理组以及维生素C处理组两两间所测指标的变化和差别。结果:1. LPS作用于Ana-1细胞,与对照组相比较,细胞内ROS的表达浓度增高(P0.01);总SOD的表达减少;彗星实验检测出Ana-1细胞DNA有损伤(P0.01),提示LPS处理可诱导Ana-1细胞的氧化应激损伤。氧化应激下LPS诱导的Ana-1细胞内的ROS的表达浓度较LPS处理组显著增高,(P0.01);总SOD的表达减少(P0.01);彗星实验检测出Ana-1细胞DNA显著损伤(P0.01)。2.共聚焦显微镜下观察对照组、LPS处理组、LPS+H_2O_2处理组的ROS荧光强度和荧光数量发现:LPS处理组的ROS荧光强度和荧光数量与对照组相比较有所增加(P0.01);LPS+H_2O_2处理组的ROS荧光强度和荧光数量较LPS处理组显著增加(P0.01)。3.RT-PCR法检测自噬相关因子LC3-Ⅱ的mRNA表达水平变化发现:LPS+H_2O_2处理组较LPS处理组的LC3-Ⅱ的mRNA表达水平量多;LPS处理组较对照组的LC3-Ⅱ的mRNA表达水平量多。4.共聚焦显微镜下观察对照组、LPS处理组、LPS+H_2O_2处理组和维生素C处理组的GFP-LC3和RFP-LC3转染发现:LPS处理组较对照组的自噬小体有所增加;LPS+H_2O_2处理组较LPS处理组的自噬小体在胞质内表达显著增加;维生素C处理组较LPS+H_2O_2处理组的自噬小体有所减少。5.Western Blot法检测自噬基因BECN1蛋白表达发现:LPS处理组较对照组的BECN1表达水平量增加(P0.01);LPS+H_2O_2处理组较LPS处理组的BECN1表达水平量增加(P0.01)。Western Blot法检测自噬基因LC3Ⅰ/Ⅱ蛋白发现:LPS处理组较对照组的LC3表达水平量增加(P0.01);LPS+H_2O_2处理组较LPS处理组的LC3表达水平量增加(P0.01);维生素C处理组较LPS+H_2O_2处理组的LC3表达水平量减少(P0.01)。结论:1.LPS可诱导小鼠肺巨噬细胞Ana-1的氧化应激,导致细胞损伤。氧化应激下LPS诱导小鼠肺巨噬细胞Ana-1的氧化应激加强,加重细胞的DNA损伤。2.氧化应激下LPS诱导小鼠肺巨噬细胞Ana-1的自噬加强,上调自噬相关蛋白BECN1和LC3Ⅰ/Ⅱ蛋白的表达,这与氧化应激造成细胞DNA损伤有关。3.通过抗氧化剂维生素C处理发现,维生素C能降低氧化应激下LPS诱导小鼠肺巨噬细胞Ana-1的GFP-LC3和RFP-LC3的转染表达以及自噬基因LC3Ⅰ/Ⅱ蛋白,再次证明氧化应激加强LPS诱导下小鼠肺巨噬细胞Ana-1的细胞损伤,以而加重细胞自噬现象。关键词:小鼠肺巨噬细胞论文氧化应激论文脂多糖论文自噬论文维生素C论文

    摘要4-8

    Abstract8-12

    前言12-16

    材料和策略16-34

    结果34-49

    讨论49-54

    结论54-55

copyright 2003-2024 Copyright©2020 Powered by 网络信息技术有限公司 备案号: 粤2017400971号