PGRMC1调节乳腺癌细胞化疗敏感性,

摘要：乳腺癌是妇女最常见的恶性肿瘤之一。近年来,乳腺癌发病率呈显著上升走势,流行病学调查表明,25-35岁乳腺癌发病大幅增加。10年间平均增加速度高达10.7%。55-65岁为第二个发病高峰,在一些大中城市已跃居女性恶性肿瘤的首位或第二位,已逐渐成为威胁女性生命健康最常见的疾病之一。乳腺癌的早期发现、早期诊断和早期治疗是提升患者存活率和存活质量的关键,由此寻找合适的能够预测乳腺癌浸润转移等生物学行为的指标,使各类各期乳腺癌尽量得到最恰当的最现代的治疗,提升病人的存活率、治愈率,以及改善患者的存活质量,是我们临床医生面对的重要课题。自20世纪以来,随着分子生物学探讨的迅速进展,有关肿瘤发生的基因学说已经受到普遍重视。新近探讨表明,肿瘤的发生是多基因参与和多阶段协同作用的结果,导致细胞恶变的癌基因多由突变产生,编码所产生的变异蛋白使细胞具有恶性特点,促使细胞分化和无限制生长。目前有关乳腺癌基因及一些相关因子的探讨甚多,是近年来乳腺癌探讨的重点和热点。探讨证实,50-80%的乳腺癌中发现了经典的雌激素受体ER-α, ER-α阳性与良好的预后相关,包括细胞增殖率降低,肿瘤分化的组织学证据,以及是否进行抗雌激素内分泌治疗,但ER-α的状态同时也预示着恶性转移位点。ER-α阳性的肿瘤早已被证实发生骨,软骨及生殖系统的转移的可能性很大,而ER-a阴性的肿瘤则发生脑肝转移更为普遍。Flototto基于ER-α阳性和阴性的恶性肿瘤的差别蛋白组学浅析意外的发现在ER-a阴性的这些乳腺癌中出现大量细胞色素b5区域蛋白PGRMC1高表达且磷酸化的亚群。PGRMC1可能与激素相关肿瘤的恶性增殖及化疗敏感性密切相关,尤其是作为乳腺癌发生进展相关的新的生物指标具有良好前景。本课题探讨共分为三章第一章PGRMC1在乳腺癌的表达及其生物学作用目的探讨孕激素膜受体1(progesterone receptor membrane component-1, PGRMC1)在乳腺癌中的表达情况及与临床病理指标的可能联系。策略1.采取免疫组织化学策略回顾性浅析检测60例乳腺癌PGRMC1的表达,并评价其与病理分级、临床分期、转移,化疗敏感性以及预后之间的联系。2.统计学处理：资料数据采取SPSS16.0版统计软件进行浅析。PGRMC1阳性表达和乳腺癌临床病理学的计数资料采取Fisher确切概率法、x2检验判断PGRMC1表达与各临床病理指标的相互联系,随访材料的患者存活情况用Kaplan-Meier策略进行浅析,存活率比较用Log-rank检验。P0.05为差别有统计学作用。结果60例乳腺癌组织PGRMC1表达阳性37例,阴性23例。PGRMC1的表达与乳腺癌淋巴结转移(P=0.004)、肿瘤大小(P=0.03)和临床分期(P=0.039)密切相关；与年龄(P=0.196)和肿瘤病理分级(P=0.526)无关。PGRMC1的表达与乳腺癌患者的总体存活率(Log-rank=10.378;P=0.0001)和无瘤存活率(Log-rank=4.443;P=0.035)有关。多因素浅析结果提示PGRMC1是乳腺癌独立的勺预后因子(P=0.002)结论PGRMC1的表达在乳腺癌中有统计学作用,其表达随转移和临床分期升高而增强,可能是乳腺癌的独立预后因素之一。第二章PGRMC1参与调控乳腺癌细胞增殖及化疗敏感性的实验探讨目的探讨孕激素膜受体1(progesterone receptor membrane component-1, PGRMC1)是否参与乳腺癌细胞增殖及化疗药物敏感性的调控。策略1.设计合成以PGRMC1为靶标的siRNA1、2,用ppofectin2000转染入的乳腺痛高转移细胞株MDA-MB-231(ER-,PR-)和低转移细胞株MCF-7(ER+,PR+), QRT-PCR检测转染siRNAs后PGRMC1基因mRNA水平变化,WB法检测蛋白表达变化,以siRNA-GFP为阳性对照,未处理组为空白对照。CCK8法检测转染前后DTX敏感性。运用1/2的IC50DTX作用转染组与对照组,流式细胞仪检测各组细胞周期变化,Annexin V/PI阳性细胞百分比,比较各组细胞凋亡率、死亡率,双氢二氯荧光黄染色阳性率判定各组细胞内ROS水平。JC-1染色后,免疫荧光显微镜下观察各组细胞线粒体膜电位变化。2.统计学处理：计量资料采取均数±标准差表示,采取SPSS13.1软件包进行统计学检验。统计策略采取独立样本t检验,p0.05被认为具有统计学作用。结果以PGRMC1为靶标设计的siRNA1、2对该基因mRNA及蛋白表达显著抑制在70%以上,细胞增殖受抑,对化疗药物敏感性增高,与非转染组相比G2期细胞比例显著增加,凋亡细胞比率显著增加,细胞内ROS水平也随之升高,线粒体膜电位下调。结论PGRMC1参与了乳腺癌细胞增殖及化疗敏感性的调控。第三章miR-128参与PGRMC1调控乳腺癌化疗敏感性的实验探讨目的前期探讨提示经干预细胞PGRMC1表达后,化疗引起细胞线粒体凋亡途径显著活化,芯片显示miR-128表达显著下调,经软件预测miR-128靶标,本课题将探讨方向聚焦在线粒体凋亡相关因子Bax。策略细胞miR转染24小时后收取细胞提取miRNA或mRNA,转染48小时内收取细胞提取蛋白质备用。分别将化学合成的成熟miR-128的MIMIC与pmiR-REPORT-Bax质粒及阴性对照在96孔板中用Lipofectamine进行共转染,转染24小时以后,进行双荧光检测。然后原位杂交检测miR-128。结果本课题通过荧光素酶报告系统证实Bax为miR-128的靶标,调节miR-128的水平可显著影响细胞化疗敏感性,抑制Bax表达,可逆转miR-128促凋亡的作用。结论本探讨的结果表明,miR-128的水水与乳腺痛细胞药物敏感负相,其关键调控因子予即凋亡相关因子BaX。关键词：
【学位授予单位】：论文南方医科大学
【学位级别】：论文博士
【学位授予年份】：论文2012
【分类号】：论文R737.9
【目录】：论文

摘要3-7

ABSTRACT7-13

前言13-25