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摘要：目的：血管平滑肌细胞（vascular ooth muscle cells, VC）表型转化是高血压、动脉粥样硬化、血管再狭窄等血管重塑性疾病的主要细胞病理学基础。KLF4（Krüppel-pke factor4）是Krüppel样转录因子家族的成员之一，该家族是具有锌指结构的一类转录因子家族，广泛的参与胚胎发育、细胞分化和癌症发生等历程。KLF4主要定位于胞核，通过激活分化标志基因（如 α-actin、22α）的表达，发挥抑制细胞增殖、诱导分化的作用。目前对KLF4功能主要局限在细胞核，关于KLF4在胞浆的分布及其功能尚少有报道。我们前期探讨发现，PDGF-BB可以推动KLF4表达和核输出，但KLF4在胞浆中的定位和功能尚不清楚。本探讨以PDGF-BB为诱导因素，探讨了KLF4调节细胞骨架重构的分子机制。策略：细胞免疫荧光染色浅析检测KLF4与细胞骨架的相互作用；Western blot浅析检测KLF4出入核的途径；GST pull-down浅析检测KLF4与actin相互作用的结构基础；报告基因浅析检测KLF4对22α启动子活性的影响。结果：1CRM1介导KLF4出核用CRM1阻断剂LMB（20ng/mL）预处理VC8h后，再给予PDGF-BB（20ng/mL）刺激VC2h，分别提取胞浆蛋白和胞核蛋白进行Western blot浅析。结果显示，与对照组相比，LMB可以显著抑制PDGF-BB对KLF4出核的诱导作用。细胞免疫荧光染色结果也显示，与对照组相比，PDGF-BB处理增加KLF4在胞浆中的分布，给予LMB预处理后，胞浆中几乎看不到KLF4分布。提示，PDGF-BB通过CRM1途径诱导KLF4核输出。2KLF4参与细胞骨架重构，具有稳定细胞骨架的作用用pEGFP-N1和pEGFP-N1-KLF4质粒转染VC后，再用PDGF-BB、细胞骨架聚合剂（JPK)、细胞松弛素(CB)处理细胞，观察KLF4亚细胞定位的变化。细胞免疫荧光染色结果显示，对照组细胞含有大量平行束状纤维，PDGF-BB刺激后，束状分布的应力纤维减少，肌丝排列成为网状。CB刺激后，应力纤维消失，微丝解聚，呈弥散状分布于胞质中，细胞无法维持正常的形态。相反，JPK则使细胞应力纤维变的粗大。KLF4过表达可以推动肌丝成束，应力纤维增粗。转染KLF4后再给予PDGF-BB刺激，肌丝仍保持束状排列，没有显著的网格化转变；还发现过表达KLF4也可以抵抗CB诱导的应力纤维解聚，提示，KLF4在胞浆中有稳定细胞骨架的作用。3KLF4通过与actin相互作用参与细胞骨架重构为了明确KLF4参与细胞骨架重构及稳定细胞骨架的作用是否与其和 α-actin相互作用有关，我们分别用PDGF-BB、CB、JPK处理VC2h后，观察KLF4与actin的相互作用。免疫双荧光细胞共定位浅析结果显示，PDGF-BB使KLF4在胞浆中的分布增加，并与actin在胞浆外边缘相互重合为荧光；CB使肌丝解聚为弥散状，且胞浆中TRITC标记的KLF4与FITC标记的actin无显著的荧光重叠；JPK使肌丝聚合呈束状，应力纤维粗大，KLF4与actin共定位更加显著。上面陈述的结果表明，KLF4通过与actin相互作用调节细胞骨架的解聚和聚合。4KLF4分子中第117-181位氨基酸是actin与KLF4结合所必须的为了进一步明确KLF4与actin相互作用的结构基础，我们用KLF4不同截短体表达质粒转化宿主菌，经IPTG诱导后通过GST亲和层析纯化，得到分子量不同的的GST-KLF4-2、GST-KLF4-3、GST-KLF4-4、GST-KLF4-全长融合蛋白。将结合有5种融合蛋白的GST-Sepharose4B与VC融合蛋白裂解液共孵育8h，沉淀经充分洗涤后，进行SDS-PAGE分离及Western blot浅析。结果显示，GST-KLF4-3与actin之间有较强的相互作用，其他融合蛋白上结合的actin较少。以上结果证实，KLF4分子中第117-181位氨基酸是actin与KLF4相互作用的结构域。5KLF4磷酸化和苏素化修饰影响细胞骨架的重构为了确定KLF4修饰与细胞骨架重构的联系，我们分别用KLF4磷酸化位点Ser-251和Ser-255突变体表达载体和苏素化位点k-225+229突变体表达载体转染VC后，给予PDGF-BB刺激，细胞免疫荧光染色法观察不同突变体对细胞骨架重构的影响。结果显示，没有给予PDGF-BB处理时，各转染组细胞骨架均为束状，无显著区别；但是给予PDGF-BB后，转染磷酸化位点突变体的细胞，细胞骨架发生显著转变，体现为应力纤维增粗，向细胞边缘聚集，细胞形态由长梭形变为多角形。转染苏素化位点突变体后，应力纤维也增粗，但排列显著无序紊乱。提示PDGF-BB诱导的KLF4磷酸化和苏素化均参与了细胞骨架重构的调节。结论：1CRM1介导KLF4出核2KLF4参与细胞骨架重构，具有稳定细胞骨架的作用3KLF4通过与actin相互作用参与细胞骨架重构4KLF4分子中第117-181位氨基酸是actin与KLF4结合所必须的5KLF4磷酸化和苏素化修饰影响细胞骨架的重构关键词：KLF4论文细胞骨架论文PDGF-BB论文血管平滑肌细胞论文actin论文CRM1论文
摘要4-7
ABSTRACT7-11
前言11-12
材料与策略12-21
结果21-25
附图25-38
讨论38-40
结论40-41