本站原创摘要5-7
Abstract7-13
插图或附表清单13-14
注释说明清单14-15
引言15-17
1 肠道病毒71型概述17-22
1.1 EV71的发现及流行17-18
1.2 EV71的结构及理化性质18-22
1.2.1 病毒粒子结构18-19
1.2.2 病毒基因组结构19-20
1.2.3 病毒的理化性质20-22
2 EV71对Ⅰ型干扰素的抵抗作用的探讨22-46
2.1 试验材料22-24
2.1.1 主要试剂22
2.1.2 主要的工具酶、试剂盒和分子量标准22
2.1.3 细胞和病毒22
2.1.4 质粒及引物22
2.1.5 主要仪器设备22-23
2.1.6 溶液及缓冲液的配制23-24
2.1.6.1 细胞培养液细菌培养液的配制23
2.1.6.2 干扰素(α、β)储存液的配制23
2.1.6.3 核酸电泳缓冲液的配制23-24
2.2 试验策略24-40
2.2.1 细胞的复苏24
2.2.1.1 HeLa细胞的复苏24
2.2.1.2 RD细胞的复苏24
2.2.2 细胞的传代培养24-25
2.2.3 细胞计数25
2.2.4 细胞的冻存25-26
2.2.5 病毒的扩增26-27
2.2.5.1 rHSV-1在HeLa细胞中的扩增26
2.2.5.2 EV71在RD细胞中的扩增26-27
2.2.6 病毒毒力的测定(TCID50)27-28
2.2.6.1 rHSV毒力的测定27
2.2.6.1.1 细胞培养及96孔板预板(HeLa)27
2.2.6.1.2 rHSV病毒接种27
2.2.6.2 EV71毒力的测定27-28
2.2.6.2.1 细胞培养及96孔板预板(RD)27-28
2.2.6.1.2 EV71病毒接种28
2.2.7 干扰素(α、β)对HSV-1的影响28-30
2.2.7.1 干扰素(α、β)作用剂量及时间的摸索28-30
2.2.7.2 荧光显微镜下观察干扰素(α、β)对rHSV-1的影响30
2.2.7.3 PCR检测干扰素(α、β)对HSV-1的影响30
2.2.8 干扰素(α、β)对EV71的影响30-33
2.2.9 EV71的2A蛋白酶破坏干扰素(α、β)的抗病毒作用33-40
2.2.9.1 2A基因真核表达质粒的构建和鉴定33-39
2.2.9.1.1 引物设计33
2.2.9.1.2 EV71-2A目的基因的获得33-35
2.2.9.1.2.1 提取病毒核酸33-34
2.2.9.1.2.2 RT-PCR得到目的基因及目的基因的回收34-35
2.2.9.1.3 EV71-2A目的基因的克隆35-36
2.2.9.1.4 EV71-2A基因连接T克隆载体及pcDNA3.1质粒提取及酶切鉴定36-37
2.2.9.1.5 EV71-2A基因真核表达载体的构建37
2.2.9.1.6 EV71-2A基因真核表达质粒的鉴定37
2.2.9.1.7 EV71-2A基因真核表达质粒的大量提取37-39
2.2.9.2 2A对干扰素(α、β)的影响39-40
2.2.9.2.1 2A转染HeLa细胞39
2.2.9.2.2 荧光显微镜下观察2A对干扰素(α、β)作用的影响39-40
2.3 试验结果40-46
2.3.1 病毒毒力的测定(TCID50)40
2.3.1.1 rHSV TCID50的测定的鉴定40
2.3.1.2 EV71 TCID50的测定40
2.3.2 干扰素(α、β)对HSV-1的影响40-42
2.3.2.1 干扰素(α、β)的浓度和剂量的摸索40-41
2.3.2.2 荧光显微镜下观察干扰素(α、β)对rHSV-1的影响41-42
2.3.2.3 PCR检测干扰素(α、β)对rHSV-1的影响42
2.3.3 干扰素(α、β)对EV71的影响42-43
2.3.4 EV71-2A连接T克隆载体及pcDNA3.1质粒的双酶切鉴定43-44
2.3.5 EV71-2A基因真核表达质粒的双酶切鉴定44
2.3.6 2A蛋白酶破坏干扰素的抗病毒作用44-46
实验讨论46-49
结论49-50