摘要：1探讨背景肾间质纤维化(renal interstitial fibrosis, RIF)是各种肾脏疾病进展至终末期肾衰竭的共同体现和主要病理基础。其病理转变主要是肾小管萎缩、炎症细胞浸润和过多的纤维成分在肾小管间质广泛沉积,它以过量细胞外基质(ECM)如胶原Ⅰ、Ⅲ、Ⅳ型、纤维连接蛋白和层连蛋白在肾间质积聚及肾间质成纤维细胞增生为特点。其特点为结缔组织沉积于肾实质损伤肾脏。其核心是肾小管上皮细胞间质转分化(EMT),EMT是肾小管肾细胞失去上皮细胞表型特点并体现出转型能力,并生成细胞外基质的历程。肌成纤维细胞(myofibroblast, MyoF)大量活化、增殖是RIF的关键环节,肾小管上皮细胞-肌成纤维细胞转分化(epithepal-mesenchymal transition,简称EMT)在RIF的发生、进展历程中发挥重要作用,由此,抑制EMT可以有效延缓甚至逆转肾小管纤维化历程。但是,针对这一关键病理环节,目前尚无有效的治疗策略。中医药治疗慢性肾纤维化具有疗效好、副作用小的优势。由此,深入探讨中医益气活血降浊方对EMT的作用对中医药防治肾纤维化有重要作用。中医认为,本病的病机以脾肾亏虚为本,湿瘀互阻为标。治疗以扶正祛邪,标本兼治,治则为益气活血,利湿降浊。以戴希文为首的老一辈肾病专家通过对大量CRF病例观察探讨出以益气活血降浊法为主的益肾降压方(生黄芪、当归、川芎、赤芍、大黄等)。前期临床探讨发现该方确能延缓慢性肾衰竭的进展,改善病人生活质量,减少终点事件发生。基础探讨发现益气活血法可以通过降低TGF-β1、提升ad6、7的表达；恢复基质金属蛋白酶及其抑制因子间的平衡；减少细胞外基质的异常积聚减轻或抑制了肾纤维化进程,有效延缓肾衰大鼠进行性的肾功能损害。2探讨目的通过信号转导通路TGF-β1/ads、p38MAPK、Rho-ROCK等途径探讨益气活血法对EMT抑制作用的分子机制,来阐明益气活血法防治肾纤维化的作用机制,寻找益气活血法防治肾纤维化的作用的具体靶点和不同剂量对治疗的差别,找出肾纤维化最佳的治疗案例,为中医治疗肾纤维化以及慢性肾功能衰竭奠定较为坚实的论述基础。3探讨内容与策略本实验在前期探讨基础上,以整体、细胞、基因水平、信号转导途径,利用细胞培养的体外试验,运用电镜、免疫组化、RT-PCR、Western-blot等技术,多层次探讨益气活血法防治肾纤维化的作用机制和具体靶点,为中医药治疗肾纤维化和慢性肾衰竭提供科学依据。4结果4.1细胞形态学方面中药含药血清有逆转TGF-β1刺激HK-2细胞EMT的走势,以含药血清大剂量组为效果最为显著。4.2调控蛋白表达方面首先,益气活血降浊方能抑制肌成纤维细胞标志性蛋白α-A的表达,并恢复上皮细胞标志性蛋白E-cadherin的表达；其次,该方可显著抑制TGF/ads通路中的关键分子Smad2/3、Smad6、Smad7的表达以而抑制EMT进程。4.3细胞因子方面益气活血降浊方可以通过调节与肾小管上皮细胞中与EMT相关的细胞因子TGF-β1、HGF、BMP-7、ILK、CTGF、1型胶原的表达,来干预肾小管上皮细胞的EMT进程。4.4调控DNA表达方面调控rhoA和p38基因的表达未发现显著转变,但中药中剂量组对p38MAPK基因的表达可能有抑制作用。5结论益气活血降浊方能抑制肌成纤维细胞标志性蛋白α-A的表达,抑制TGF/ads通路中的关键分子Smad2/3、Smad6、Smad7的表达,抑制与EMT相关的细胞因子TGF-β1、ILK、CTGF、I型胶原的表达,并恢复上皮细胞标志性蛋白E-cadherin的表达,提升与抑制EMT有关的细胞因子HGF、BMP-7的表达,以而抑制EMT进程发挥抗肾小管间质纤维化作用。关键词：肾纤维化论文肾小管上皮细胞转分化论文益气活血降浊方论文慢性肾衰论文
中文摘要6-8
Abstract8-11
英文缩略语11-12
第一章 文献综述12-38
第一节肾间质纤维化12-20
References17-20
第二章 慢性肾脏病因及流行病学进展20-28
转分化的细胞形态学观察42-472.1 实验细胞42
2.2 含药血清的制备42
2.3 实验分组和处理42-43
2.4 实验步骤43
2.5 图像结果43-45
2.6 讨论45-46
2.7 实验结论46-47
实验部分三 免疫组化法观察HK-2细胞α-A和E-Cadherin的表达47-52
3.1 实验细胞47
3.2 含药血清的制备47
3.3 实验分组和处理47
3.4 免疫组化实验步骤47-48
3.5 实验结果48-50
3.6 讨论50-51
3.7 实验结论51-52
实验部分四 ELISA检测培养液上清FN、Ⅰ型胶原、TGF-β 1、ILK、CTGF、HGF、BMP-7的含量变化52-65
4.1 主要试剂和仪器52
4.2 细胞来源及细胞培养技术52
4.3 含药血清的制备52-53
4.4 实验分组和处理53
4.5 实验步骤53
4.6 实验结果53-64
4.7 ELISA实验部分小结64-65
实验部分五 real-time PCR法检测p38 MAPK、RhoA mRNA表达65-69
5.1 实验细胞65
5.2 含药血清的制备65
5.3 实验分组和处理65
5.4 实验步骤65-67
5.5 实验结果67
5.6 讨论67-68
5.7 实验结论68-69
实验部分六 Western Blot浅析法检测ad2/3、ad6、7和ILK的蛋白表达69-75
6.1 主要试剂和仪器69
6.2 细胞来源及细胞培养技术69
6.3 含药血清的制备69-70
6.4 实验分组和处理70
6.5 益气活血降浊方(含药大鼠血清)诱导HK-2细胞70
6.6 Western blot检测Smad2/3、Smad6、Smad7和ILK的蛋白表达70-72
6.7 统计学处理72
6.8 实验结果72-73
6.9 讨论73-74
6.10 实验结论74-75
本站原创