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[摘要] 目的 考察大孔吸附树脂对九节茶浸膏中迷迭香酸的吸附性能和纯化效果，寻找分离富集迷迭香酸较优的技术工艺。 方法 以迷迭香酸的吸附量和解析率为指标，从6种不同类型大孔树脂中筛选出较好的HPD-400树脂；以动态实验中迷迭香酸转移率及所得干膏中迷迭香酸的含量对树脂分离富集的最佳工艺进行筛选。 结果 HPD-400树脂分离效果最佳，采用HPD-400树脂从九节茶浸膏中分离富集迷迭香酸的较优工艺参数为：上样体积4BV，速度2BV/h，收集洗脱液3BV，洗脱溶剂为70%乙醇。按照此工艺，迷迭香酸的平均过柱转移率为88.70%，洗脱液浓缩干燥后，所得干膏中迷迭香酸平均含量为4.57%，较原九节茶浸膏提高了5.2倍。树脂经5次重复使用，分离效果无明显下降，可以重复使用。 结论 HPD-400树脂可以用于分离富集九节茶浸膏中迷迭香酸，达到了“去粗存精”的目的，具有潜在的工业应用价值。
[关键词] 九节茶浸膏；迷迭香酸；分离；纯化；树脂
[] A [文章编号] 1673-7210（2012）12（c）-0128-04
九节茶系金粟兰科植物草珊瑚Sarcandra glabra（Thunb.）Nakai的干燥地上部分（肿节风为其全株），收载于《广东省中药材标准》（第一册），具有抗菌消炎及肿瘤抑制作用，主要化学成分为有机酸、倍半萜、黄酮及香豆素类化合物等[3-5]，文献报道[6]提示九节茶浸膏中含量较高的迷迭香酸为其中的抗炎活性成分。但尚未见从九节茶中分离富集迷迭香酸的工艺研究报道。近年来，随着大孔树脂在天然药物活性成分分离纯化方面应用的日益广泛[7-10]，其良好的分离效果和低成本可重复利用的特点，适合于生产的要求。因此，本实验采用大孔树脂法对九节茶浸膏中迷迭香酸的分离富集工艺进行研究，以期为九节茶相关制剂的工业化生产提供合理、经济、简便的分离富集工艺。
1 仪器与试药
2 方法与结果
2.1.2 迷迭香酸标准曲线的制备 精密称取迷迭香酸对照品6.15 mg，置25 mL量瓶，加60%甲醇溶液稀释定容至刻度，混匀，作为对照品母液，备用。精密量取母液5.0、2.5、1.0、0.5、0.1 mL分别置于10 mL量瓶，加60%甲醇溶液稀释定容至刻度，摇匀。按上述色谱条件进样20 μL进行测定，记录迷迭香酸对应的峰面积。以进样量为横坐标（x），峰面积为纵坐标（y），线性回归方程为y = 60 125x-57 905，r = 0.999 5，表明迷迭香酸在2.46～12
2.3.2 树脂的静态饱和解吸率 取充分饱和吸附后6种树脂，每种树脂各6份，每份各1 mL，分别置100 mL具塞磨口三角瓶中，分别加入水、10%、30%、50%、70%、90%乙醇溶液30 mL，置恒温（25℃）水浴震荡水槽上震荡，解吸附24 h后，滤过，精密量取滤液5 mL置于10 mL量瓶，加水定容至刻度。测定滤液中迷迭香酸的含量。计算室温下各树脂的静态解吸率。解析率=解析液中迷迭香酸的量/树脂中吸附迷迭香酸的量，结果见表3。由表2、3可知，XAD-4、XAD-16树脂吸附能力要大于其他各类，但是其解吸附效果并不比其他树脂好，综合考虑效果和，因此选择吸附和解析效果较好的HPD-400树脂；HPD-400比HPD-600、HPD-824吸附能力稍强，解吸附能力跟其他没有明显差别。因此，选用HPD-400树脂对迷迭香酸的分离富集工艺进行研究。
由图3可知，1∶5样液上样后第3份出现泄漏；1∶10样液上样后第5、9份出现泄漏。按树脂动态吸附浓度=泄漏点前上柱体积×样液中有效成分含量/树脂体积，得树脂的动态吸附容量分别为
水洗终点判断：取HPD-400树脂40 mL置柱中，以4BV的样液上样，控制上样流速为2BV/h，上样结束后以同样的流速水洗，每1BV收集1份，分别检测水洗液中迷迭香酸含量，收集液经浓缩，低温真空干燥，得干膏中迷迭香酸的质量分数，见表4。结果表明，随着水洗量增大，则有效成分被洗脱下来的量也越多。第2份收集液的干膏量已明显低于第1份，即1BV的水即可将大部分的水溶性杂质与大部分目标成分迷迭香酸分离，故确定洗脱剂水的最佳用量为1BV。
洗脱溶剂及醇洗终点判断：根据上述优化后条件进行上样、水洗处理后，用50%、60%、70%乙醇分别洗脱，每1BV收集1份洗脱液，共收集6份，按照“2.1.1”项下方法测定迷迭香酸含量。累积洗脱百分比=洗脱液中迷迭香酸的量/样液中迷迭香酸的量，结果见表5及图4。
根据表5结果，50%乙醇洗脱溶剂取前4份洗脱液，60%、70%乙醇洗脱液选择前3份洗脱液分别浓缩，低温真空干燥，得干膏。根据溶剂用量，出膏量、干膏中迷迭香酸的质量分数、转移率及除杂率为指标，确定洗脱溶剂。结果见表6。结果表明，三种溶剂洗脱的迷迭香酸转移率[转移率=洗脱液中迷迭香酸的含量×洗脱体积/（样液中迷迭香酸的含量×上样体积）]相差不大，但70%乙醇洗脱的除杂效果最好[除杂率=1－（洗脱液浓缩所得干膏量/原九节茶浸膏量）]，且溶剂用量最少。综合考虑选用70%乙醇，作为洗脱溶剂。
2.4.3 最佳洗脱流速考察 量取HPD-400大孔吸附树脂3份，每份40 mL，按照上述考察优化后的条件进行上样、水洗，最后用70%乙醇分别以1BV/h、2BV/h、4BV/h不同洗脱流速下进行洗脱，每1BV收集1份洗脱液，共收集6份，按照“2.1.1”项下方法测定迷迭香酸含量。结果见图5。不同流速洗脱都需要3BV的洗脱液才能将有效成分洗脱完全。
根据图5结果，不同洗脱速度下分别将前3份收集液进行低温真空干燥，得干膏。根据出膏量、干膏中迷迭香酸的质量分数及干膏除杂率为指标，确定洗脱流速。结果见表7。综上所得，以2BV/h所得干膏最少，除杂效果最佳，且迷迭香酸的含量也最高。因此选择2BV/h作为最佳洗脱速度。
取新的HPD-400大孔吸附树脂，根据上述的最佳吸附及洗脱条件，在同一根树脂柱上进行上样与洗脱。每次洗脱结束后按照上述再生方法再生，再上样洗脱，反复上样洗脱5次。对迷迭香酸的转移率为72.07%～76.34%，平均迷迭香酸的转移率达到73.06%。新树脂对迷迭香酸的转移率为86.68%，经再生后树脂的对迷迭香酸的富集能力比新树脂有所下降，但其后树脂的能力变化不大，比较稳定。根据“大孔吸附树脂分离纯化技术专题讨论会会议”上提出的分离同一物质树脂吸附能力下降30%即不能再重复利用的标准，该树脂可以再生重复使用。
3 讨论
对大多数的物质而言，温度升高，物质分子活动加强。大孔树脂的吸附量和吸附力与温度成反比，温度升高后，吸附作用下降。而解吸附则适合在高温下进行。由于本实验时间跨度较长，最佳溶剂考察与工艺验证考察季节不同，实验室内温度相差较大，造成最佳溶剂考察与验证工艺实验结果中迷迭香酸转移率的差异较大，具体作用有待于今后试验过程中解决。
[关键词] 九节茶浸膏；迷迭香酸；分离；纯化；树脂
[] A [文章编号] 1673-7210（2012）12（c）-0128-04
九节茶系金粟兰科植物草珊瑚Sarcandra glabra（Thunb.）Nakai的干燥地上部分（肿节风为其全株），收载于《广东省中药材标准》（第一册），具有抗菌消炎及肿瘤抑制作用，主要化学成分为有机酸、倍半萜、黄酮及香豆素类化合物等[3-5]，文献报道[6]提示九节茶浸膏中含量较高的迷迭香酸为其中的抗炎活性成分。但尚未见从九节茶中分离富集迷迭香酸的工艺研究报道。近年来，随着大孔树脂在天然药物活性成分分离纯化方面应用的日益广泛[7-10]，其良好的分离效果和低成本可重复利用的特点，适合于生产的要求。因此，本实验采用大孔树脂法对九节茶浸膏中迷迭香酸的分离富集工艺进行研究，以期为九节茶相关制剂的工业化生产提供合理、经济、简便的分离富集工艺。
1 仪器与试药
1.1 仪器
Waters E2695 Separetiongs Module Hplc系统，Waters 2998二级管阵列检测器和Empower软件；METTLER AE240天平；BFX5-320型低速离心机；电热恒温震荡水槽；电热恒温鼓风干燥箱DHG-9240A；三用恒温水箱DK-600S；数控超声波提取器。1.2 试药
D101大孔吸附树脂，国药集团化学试剂有限公司产品；XAD-4，XAD-16均为aladdin产品，HPD-400，HPD-600，HPD-826均为沧州宝恩吸附材料科技有限公司产品；迷迭香摘自：毕业论文 格式www.udooo.com
酸对照品（批号：111871-201001，中国药品生物制品检定所）；九节茶浸膏（批号：20100301，由三明华健生物工程有限公司参照《中国药典》2010年版一部“肿节风浸膏”制法项下工艺生产提供）；乙腈为色谱纯（Fisher公司）；乙醇为分析纯；水为超纯水，其他试剂均为分析纯。2 方法与结果
2.1 迷迭香酸的含量测定[11-12]
2.1.1 色谱条件 色谱柱：Hypersil ODS（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流动相：A为乙腈（含0.1%甲酸），B为0.1%甲酸溶液，梯度洗脱；柱温：30℃；检测波长：330 nm；进样量：20 μL；流速：1 mL/min。在上述条件下，流动相梯度洗脱程序及流速见表1，色谱图见图1、2。2.1.2 迷迭香酸标准曲线的制备 精密称取迷迭香酸对照品6.15 mg，置25 mL量瓶，加60%甲醇溶液稀释定容至刻度，混匀，作为对照品母液，备用。精密量取母液5.0、2.5、1.0、0.5、0.1 mL分别置于10 mL量瓶，加60%甲醇溶液稀释定容至刻度，摇匀。按上述色谱条件进样20 μL进行测定，记录迷迭香酸对应的峰面积。以进样量为横坐标（x），峰面积为纵坐标（y），线性回归方程为y = 60 125x-57 905，r = 0.999 5，表明迷迭香酸在2.46～12
3.00 μg/mL范围内进样量与色谱峰面积具有良好的线性关系。
2.1.3 上柱溶液的制备及测定 称取九节茶浸膏300 g，加入水3 000 mL，超声搅拌溶解，离心（3 600 r/min，15min），取上清液备用。精密量取上清液2 mL，置100 mL量瓶，加水稀释定容至刻度，0.45 μm滤膜过滤，按“2.1.1”项下条件进样，测定迷迭香酸含量为0.87%。2.2 树脂的预处理
取上述6种树脂分别以95%乙醇浸泡24 h，充分溶胀，用乙醇洗至流出液加水（1∶5）无白色浑浊现象，再用蒸馏水洗至无醇味即得。2.3 静态实验
2.3.1 树脂的静态饱和吸附量 量取已处理的树脂各30 mL，分别置于250 mL具塞磨口三角瓶中，加入“2.1.3”项下的上清液200 mL，置恒温（25℃）水浴震荡水槽上震荡吸附24 h后，滤过，精密量取滤液5 mL，置100 mL量瓶，加水稀释定容至刻度。按“2.1.1”项下条件测定滤液中剩余迷迭香酸的含量。计算室温下各树脂的静态饱和吸附量。静态饱和吸附量=（上清液中迷迭香酸的量-滤液中迷迭香酸的量）/树脂体积，结果见表2。2.3.2 树脂的静态饱和解吸率 取充分饱和吸附后6种树脂，每种树脂各6份，每份各1 mL，分别置100 mL具塞磨口三角瓶中，分别加入水、10%、30%、50%、70%、90%乙醇溶液30 mL，置恒温（25℃）水浴震荡水槽上震荡，解吸附24 h后，滤过，精密量取滤液5 mL置于10 mL量瓶，加水定容至刻度。测定滤液中迷迭香酸的含量。计算室温下各树脂的静态解吸率。解析率=解析液中迷迭香酸的量/树脂中吸附迷迭香酸的量，结果见表3。由表2、3可知，XAD-4、XAD-16树脂吸附能力要大于其他各类，但是其解吸附效果并不比其他树脂好，综合考虑效果和，因此选择吸附和解析效果较好的HPD-400树脂；HPD-400比HPD-600、HPD-824吸附能力稍强，解吸附能力跟其他没有明显差别。因此，选用HPD-400树脂对迷迭香酸的分离富集工艺进行研究。
2.4 动态实验
2.4.1 上样液溶度对树脂吸附性能的影响 大孔吸附树脂主要通过表面吸附、表面电性或氢键等作用，具有一定吸附容量。当达到吸附饱和时，此时其中成分即泄漏流出，故需考察树脂的泄漏点，来确定上柱的最佳药量。分别称取九节茶浸膏适量，按照1∶5、1∶10、1∶20的比例加水，超声搅拌溶解，摘自：毕业论文提纲www.udooo.com
离心（3 600 r/min，15 min）取上清液备用。分别取HPD-400树脂40 mL 3份，置柱中，处理好后，用上述3种不同溶度的样液以2BV/h的速度上样，每1BV收集1份，检测其中迷迭香酸的含量。当出现泄漏时即停止收集。泄漏曲线见图3。由图3可知，1∶5样液上样后第3份出现泄漏；1∶10样液上样后第5、9份出现泄漏。按树脂动态吸附浓度=泄漏点前上柱体积×样液中有效成分含量/树脂体积，得树脂的动态吸附容量分别为
2.76、3.56、23 mg/mL。可见样液浓度过低或者过高都不利于吸附的进行。
2.4.2 吸附终点考察 由于过量水洗不仅将极性较大杂质成分去除，同时也将部分迷迭香酸解吸下来，因此本实验包括两部分：水洗终点的判断及醇洗终点的判断。水洗终点判断：取HPD-400树脂40 mL置柱中，以4BV的样液上样，控制上样流速为2BV/h，上样结束后以同样的流速水洗，每1BV收集1份，分别检测水洗液中迷迭香酸含量，收集液经浓缩，低温真空干燥，得干膏中迷迭香酸的质量分数，见表4。结果表明，随着水洗量增大，则有效成分被洗脱下来的量也越多。第2份收集液的干膏量已明显低于第1份，即1BV的水即可将大部分的水溶性杂质与大部分目标成分迷迭香酸分离，故确定洗脱剂水的最佳用量为1BV。
洗脱溶剂及醇洗终点判断：根据上述优化后条件进行上样、水洗处理后，用50%、60%、70%乙醇分别洗脱，每1BV收集1份洗脱液，共收集6份，按照“2.1.1”项下方法测定迷迭香酸含量。累积洗脱百分比=洗脱液中迷迭香酸的量/样液中迷迭香酸的量，结果见表5及图4。
根据表5结果，50%乙醇洗脱溶剂取前4份洗脱液，60%、70%乙醇洗脱液选择前3份洗脱液分别浓缩，低温真空干燥，得干膏。根据溶剂用量，出膏量、干膏中迷迭香酸的质量分数、转移率及除杂率为指标，确定洗脱溶剂。结果见表6。结果表明，三种溶剂洗脱的迷迭香酸转移率[转移率=洗脱液中迷迭香酸的含量×洗脱体积/（样液中迷迭香酸的含量×上样体积）]相差不大，但70%乙醇洗脱的除杂效果最好[除杂率=1－（洗脱液浓缩所得干膏量/原九节茶浸膏量）]，且溶剂用量最少。综合考虑选用70%乙醇，作为洗脱溶剂。
2.4.3 最佳洗脱流速考察 量取HPD-400大孔吸附树脂3份，每份40 mL，按照上述考察优化后的条件进行上样、水洗，最后用70%乙醇分别以1BV/h、2BV/h、4BV/h不同洗脱流速下进行洗脱，每1BV收集1份洗脱液，共收集6份，按照“2.1.1”项下方法测定迷迭香酸含量。结果见图5。不同流速洗脱都需要3BV的洗脱液才能将有效成分洗脱完全。
根据图5结果，不同洗脱速度下分别将前3份收集液进行低温真空干燥，得干膏。根据出膏量、干膏中迷迭香酸的质量分数及干膏除杂率为指标，确定洗脱流速。结果见表7。综上所得，以2BV/h所得干膏最少，除杂效果最佳，且迷迭香酸的含量也最高。因此选择2BV/h作为最佳洗脱速度。
2.5 最佳工艺的确定及验证
按照上述所确定的最佳吸附和解析条件，取样品液进行上柱、吸附、洗脱。洗脱液经浓缩回收乙醇后，低温干燥，得干膏。重复3次，产品经分析其迷迭香酸的质量分数平均为4.57%，较原九节茶浸膏的0.87%含量，提高了5.2倍；过柱后出膏量平均2.6 g占原16 g浸膏的16.3%，即过柱除杂率平均为83.70%；经计算出迷迭香酸过柱转移率平均为88.70%。见表8。
2.6 树脂重复使用周期考察
树脂再生方法：每次洗脱结束后，用95%乙醇洗至流出液无色，然后加水洗至无醇味；加1 mol/L HCl，浸泡30 min，淋洗至无色，加水洗至中性；接着加1 mol/L NaOH，浸泡30 min，淋洗至无色，加水洗至中性。取新的HPD-400大孔吸附树脂，根据上述的最佳吸附及洗脱条件，在同一根树脂柱上进行上样与洗脱。每次洗脱结束后按照上述再生方法再生，再上样洗脱，反复上样洗脱5次。对迷迭香酸的转移率为72.07%～76.34%，平均迷迭香酸的转移率达到73.06%。新树脂对迷迭香酸的转移率为86.68%，经再生后树脂的对迷迭香酸的富集能力比新树脂有所下降，但其后树脂的能力变化不大，比较稳定。根据“大孔吸附树脂分离纯化技术专题讨论会会议”上提出的分离同一物质树脂吸附能力下降30%即不能再重复利用的标准，该树脂可以再生重复使用。
3 讨论
3.1 树脂的吸附能力
应用大孔吸附树脂分离纯化中药有效成分，是利用其吸附的可逆性及其多孔网状结构的筛选性。由于树脂极性、孔径、比表面积不同，对迷迭香酸吸附作用力强弱不同，解吸难易也有别。应用高效液相色谱法进行分析检验，经实验从6种大孔树脂中选择出了吸附和解析效果较好的HPD-400树脂。对大多数的物质而言，温度升高，物质分子活动加强。大孔树脂的吸附量和吸附力与温度成反比，温度升高后，吸附作用下降。而解吸附则适合在高温下进行。由于本实验时间跨度较长，最佳溶剂考察与工艺验证考察季节不同，实验室内温度相差较大，造成最佳溶剂考察与验证工艺实验结果中迷迭香酸转移率的差异较大，具体作用有待于今后试验过程中解决。
摘自：毕业论文提纲www.udooo.com