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摘要：背景及目的我国乙型病毒性肝炎发病率高(约5%)，在慢性乙型肝炎基础上诱发的重型肝炎病情尤为凶险，病情进展迅速，病死率较高，可达到70%以上，一直备受临床医生和探讨人员的重视。目前内科治疗对于该疾病的作用有限，虽然肝移植是终末期肝病治疗的最终选择，但因我国面对严重的供体短缺、移植昂贵等不足而受到临床运用的限制，由此免疫治疗为重型肝炎的治疗提供了新的思路。重型乙型肝炎发病机制复杂，涉及到病毒和宿主双重因素。其中免疫介导的肝细胞损伤中，乙型肝炎病毒（HBV）抗原特异性细胞毒性T细胞（CTL）细胞的作用及机制已经得到较好阐明，而非特异性免疫在其中的作用却尚不明确。本探讨室的前期探讨首次揭示肝脏自然杀伤细胞（NK细胞）在病毒诱导的肝损伤中发挥至关重要的作用。本探讨室前期通过基因芯片对重症乙型肝炎患者和轻中度慢性乙型肝炎患者的外周血单个核细胞的基因差别表达谱探讨，发现离子通道相关基因--potassium channeltetramerisation domain containing9（KCTD9）在慢性乙肝的重症阶段患者的外周血单个核细胞（PBMC）中高度表达，是重型乙型肝炎的一个下调基因。进一步通过对我探讨室建立的不同类型的小鼠肝炎模型和不同临床类型的乙型肝炎患者（重型肝炎和轻中度慢性肝炎患者）及健康对照组患者外周淋巴细胞和肝淋巴细胞的表达探讨发现，KCTD9表达水平在外周血NK细胞和肝脏NK细胞上显著增高，其表达与重型肝炎患者肝脏受损的严重程度呈正相关。对鼠三型肝炎病毒（MHV-3）诱导的Balb/cJ暴发型肝炎小鼠模型中干预KCTD9的表达，能够有效抑制NK细胞活化及延缓暴发型肝炎的疾病进展。这一系列探讨为进一步探讨重症肝炎的肝细胞损伤机制，提供了新的方向和疾病干预靶点。为进一步探讨KCTD9的免疫功能，本探讨克隆了人KCTD9开放阅读框（ORF）全长，构建其表达质粒。同时，为进行进一步的信号转导途径的相关探讨，我们构建了该基因的慢病毒表达载体。这些均为KCTD9分子的功能探讨提供了强有力的前提保证，也为下一步的探讨打下坚实的基础。探讨策略1.收集重型乙型肝炎病人外周血，提取PBMC的总RNA,逆转录为cDNA后作为模板，PCR策略扩增KCTD9ORF区，并连接到pcDNA3.1质粒上，转化感受态细胞，阳性克隆PCR后小提质粒，进行双酶切及双向测序鉴定。2.构建pGC-FU-KCTD9慢病毒载体,通过测序结果和利用westernblot技术以蛋白质方面鉴定含有KCTD9的目的片段的表达。经过包装纯化，含目的基因的慢病毒颗粒可以获得较高滴度，为进行下一步的生物学功能探讨做铺垫。探讨结果1.观察双酶切的结果及测序结果证实以PBMC中获得的KCTD9基因连接到pcDNA3.1载体上，除第693位碱基由胸腺嘧啶突变胞嘧啶为外，其余都与NCBI基因文库中KCTD9基因切合，该处突变属于同义突变，不会影响其蛋白质的空间结构及蛋白质的生理功能。2.成功构建pGC-FU-KCTD9表达质粒，转染293T细胞后获得阳性克隆菌株经Western-Blotting证实其正确性，通过293T细胞进行慢病毒的包装，最终纯化出pGC-FU-KCTD9慢病毒颗粒。探讨结论1．成功构建pcDNA3.1-hKCTD9真核表达质粒；2.成功构建pGC-FU-KCTD9慢病毒表达质粒。关键词：肝衰竭论文人KCTD9论文表达质粒论文慢病毒论文
英文缩略词表5-7
中文摘要7-9
Abstract9-12
前言12-13
仪器和试剂13-18
策略18-32
结果32-43
讨论43-45