试析转基因抗GNA兔单克隆抗体制备与其夹心ELISA检测系统建立查抄袭率

摘要：雪花莲凝集素(Galanthus nivaps agglutinim, GNA)对咀嚼式害虫和刺口式吸汁性害虫具有毒杀性能而且对高等动物相对安全,作为Bt蛋白、胰蛋白酶抑制剂等杀虫毒蛋白的功能互补和增强成分,成为植物基因工程中运用最广泛的植物外源凝集素。目前,对转基因GNA蛋白的检测主要集中在基于DNA分子的遗传学检测。酶联免疫吸附法(Enzyme-pnked immunosorbent assay, ELISA)技术能够对直接关乎转基因食品安全的蛋白质进行检测,而且ELISA技术具有快速、灵敏等优点,适用于现场监控和大量样本筛查。兔单克隆抗体(monoclonal antibody, McAb)制备技术是目前相对较先进的生物技术之一。兔单克隆抗体技术运用于转基因食品蛋白的检测国内外未曾有相关报道。兔单克隆抗体相较于鼠单克隆抗体,具有能识别更多的新型表位、更高的亲和性和更强的特异性等优点。本探讨拟通过获得高质量杂交瘤细胞的基础上,运用抗体重组技术获得兔单克隆抗体,以使收集得到的兔单克隆抗体的免疫捕获能力进一步提升最终建立一种检测GNA蛋白的基于兔单克隆抗体双抗夹心ELISA检测系统。其主要实验内容和结果如下：(1)抗GNA兔多克隆抗体的制备及鉴定运用SDS-PAGE凝胶电泳对GNA免疫抗原蛋白的分子量和纯度进行检测。结果表明,GNA蛋白分子量约为14.3KDa,且纯度较高,可作为独立的抗原引起机体的免疫反应。用BCA蛋白检测试剂盒测得GNA蛋白的浓度为1.64mg/mL。采取免疫技术,将GNA蛋白与等量弗氏完全佐剂乳化后注射入两只兔子(B3365,B3366)体内。经五次免疫之后选择免疫效价较高的兔子(B3366),取全血,经Sepharose CL-4B Protein A柱分离纯化兔多抗血清,并对其纯度和效价分别进行凝胶电泳和间接ELISA检测。结果表明,所获得的抗GNA兔多克隆抗体纯度较高,几乎不含其它杂蛋白,效价在8000～32000之间。(2)抗GNA兔单克隆抗体的制备及鉴定免疫两只兔子(B3365,B3366),选取效价较高的B3366号兔子的脾脏进入细胞融合阶段。将兔子脾脏淋巴细胞与240E骨髓瘤细胞融合。运用间接ELISA法,经过初筛复筛,获得双阳性克隆子6个(zju-17-2、zju-17-3、zju-17-5、zju-17-6、zju-17-14、zju-17-17),取其中三个(zju-17-3、zju-17-5、zju-17-6)进入抗体质粒重组阶段,选取分泌单克隆抗体能力强且抗体亲和性高的配对(zju-17-5(2L/2H)),进入单克隆抗体的大转生产,最后将收集到的抗GNA兔单克隆抗体经Sepharose CL-4B Protein A柱分离纯化。经SDS-PAGE凝胶电泳浅析,证实了该兔单克隆抗体的纯度高,运用IgG检测技术和间接ELISA检测技术,分别获得该目标抗体的初始浓度为2.28mg/mL,效价在32000～128000之间,亲和常数为0.387×109L/mol。(3)检测GNA夹心ELISA系统的建立和运用用生物素标记的兔多克隆抗体,其标记率为2.40、抗体浓度为7.67×10-6mol/L、生物素浓度为1.84×10-5mol/L。经过尝试,确立的双抗夹心ELISA法是用4μg/mL抗GNA兔单克隆抗体作为一抗包被酶标板,二抗是稀释20倍的生物素标记的兔多克隆抗体。酶标抗生物素稀释400倍后加入,经显色9min,终止后测OD450。其中,GNA蛋白、生物素标记兔多抗和酶标抗生物素的稀释均用3%的脱脂牛奶。用该双抗夹心ELISA法检测GNA蛋白,检测限(LOD)可达3.9～7.8ng/mL,其线性检测范围为0.975～62.5ng/mL。为了验证该双抗夹心ELISA检测系统的实用性,将该策略运用于转GNA基因稻米的检测。通过对稻米进行预处理,再用双抗夹心ELISA法对其进行检测,并设置阴性对照和空白对照,同时制作标准曲线。试验结果表明,转GNA基因样品的OD450(0.41)显著高于阴性对照的OD450(0.17)和空白对照的OD450(0.14),如果不考虑稻米蛋白提取历程中目标蛋白的丢失,样品中GNA蛋白的含量0.08μg/g左右(GNA蛋白质量/大米重量)。关键词：雪花莲凝集素(GNA)论文单克隆抗体论文转基因食品论文ELISA论文检测论文

致谢6-7

摘要7-9

Abstract9-12

目录12-15

第一章 引言15-28

1.1 转基因作物进展态势15-16

1.2 雪花莲凝集素介绍16-20

1.2.1 植物凝集素16-18

1.2.1.1 植物凝集素的定义及分类16

1.2.1.2 植物凝集素的特点和功能16-17

1.2.1.3 植物凝集素在抗虫转基因工程中的运用17-18

1.2.2 雪花莲凝集素18-20

1.2.2.1 雪花莲凝集素的结构18

1.2.2.2 雪花莲凝集素的抗虫机理18-19

1.2.2.3 雪花莲凝集素在转基因作物抗虫害中的运用19-20

1.3 GNA转基因食品检测技术及其运用20-25

1.3.1 转基因作物的检测作用20

1.3.2 GNA转基因植物检测的近况20-21

1.3.3 兔单克隆抗体技术21-22

1.3.3.1 兔单克隆抗体技术的进展21

1.3.3.2 兔单克隆抗体技术的原理21

1.3.3.3 兔单克隆抗体技术的优势和不足21-22

1.3.4 酶联免疫吸附(ELISA)技术及其运用22-25

1.3.4.1 酶联免疫吸附(ELISA)技术22-24

1.3.4.2 ELISA法在转基因食品检测中的运用24-25

1.4 探讨作用与探讨目的25-26

1.5 探讨内容与技术案例26-28

1.5.1 主要探讨内容26-27

1.5.2 技术案例27-28

第二章 抗GNA兔多克隆抗体的制备及鉴定28-40

2.1 实验材料28-30

2.1.1 实验材料和试剂28-29

2.1.2 主要实验设备29-30

2.2 实验策略30-33

2.2.1 蛋白浓度的测定30

2.2.2 蛋白纯度浅析30-31

2.2.3 兔多克隆抗体血清的制备31

2.2.4 兔多抗血清的纯化31-32

2.2.5 多克隆抗体的纯度浅析32

2.2.6 兔多克隆抗体效价的测定32-33

2.3 试验结果与浅析33-38

2.3.1 GNA蛋白浓度的测定33-34

2.3.2 GNA蛋白纯度浅析34-35

2.3.3 抗GNA兔多克隆抗体血清的制备35

2.3.4 抗GNA兔多克隆抗体血清的纯化35-36

2.3.5 抗GNA兔多克隆抗体的纯度36-37

2.3.6 抗GNA兔多克隆抗体效价的测定37-38

2.4 本章小结38-40

2.4.1 结论38-39

2.4.2 讨论39-40

第三章 抗GNA兔单克隆抗体的制备和鉴定40-52

3.1 实验材料40-41

3.1.1 主要实验材料和试剂40

3.1.2 主要实验设备40-41

3.2 实验策略41-44

3.2.1 兔单克隆抗体的制备41-43

3.2.1.1 细胞融合41

3.2.1.2 杂交瘤细胞的筛选41-42

3.2.1.3 抗体重组技术42-43

3.2.2 兔单克隆抗体的纯化43

3.2.3 兔单克隆抗体的纯度检测43

3.2.4 兔单克隆抗体效价的测定43

3.2.5 兔单克隆抗体亲和常数的测定43-44

3.3 实验结果与浅析44-50

3.3.1 抗GNA兔单克隆抗体的制备44-46

3.3.2 抗GNA兔单克隆抗体的纯化46-47

3.3.3 抗GNA兔单克隆抗体纯度的鉴定47-48

3.3.4 抗GNA兔单克隆抗体效价测定48-49

3.3.5 抗GNA兔单克隆抗体亲和常数的测定49-50

3.4 本章小结50-52

3.4.1 结论50-51

3.4.2 讨论51-52

第四章 GNA转基因蛋白ELISA检测系统的建立52-60

4.1 实验材料52

4.1.1 主要实验材料和试剂52

4.1.2 主要实验设备52

4.2 实验策略52-55

4.2.1 生物素标抗体的制备52-53

4.2.2 生物素标记兔多克隆抗体工作浓度的确定53

4.2.3 夹心ELISA法检测GNA检测限的测定53-54

4.2.4 夹心ELISA法对样品的检测54-55

4.3 实验结果与浅析55-59

4.3.1 生物素标抗体的制备55

4.3.2 生物素标记的兔多抗的工作浓度55-56

4.3.3 GNA夹心ELISA检测策略的建立56-57

4.3.4 转基因样品检测试验57-59

4.4 本章小结59-60

第五章 结论与展望60-64

5.1 兔多克隆抗体的制备及性质的鉴定60-61

5.2 抗GNA兔单克隆抗体的制备及性质的鉴定61

5.3 生物素标记兔多克隆抗体的制备及工作浓度的确定61-62

5.4 捡测GNA夹心ELISA系统的建立和运用62

5.5 试验革新性62-63

5.6 展望63-64