链球菌无乳链球菌cpsE基因克隆、原核表达和多克隆抗体制备与其在原位PCR中运用查抄袭率怎么-turnitin论文查重

摘要：本探讨以收集自海南文昌市多个养殖场感染无乳链球菌病的罗非鱼为探讨对象,运用分子生物学手段探讨了致病菌功能基因cpsE的分子特性、原核表达及其在间接原位PCR检测策略方面的运用,旨在为进一步开展无乳链球菌cpsE基因的功能等探讨提供全面的基础实验数据,并为以无乳链球菌功能基因重组蛋白为主要抗原成分的新型渔用疫苗的研发奠定论述基础。1.无乳链球菌cpsE基因的分子特性浅析利用生物信息学软件对cpsE扩增序列进行分子特性浅析。结果显示,无乳链球菌分离株cpsE基因推导氨基酸序列具有高度保守性,与人源、动物源无乳链球菌相似性达100%；序列中Lys和Val含量最高,分别为10.7%和10.1%；推导序列第56和第142个氨基酸残基之间含有1个糖基转移酶超家族的保守结构域,具有与蛋白翻译后修饰功能相关的磷酸化位点3个,编码多肽链中亲水区大于疏水区,含有跨膜区,无信号肽序列；二级结构中,α-螺旋占的比例最大,达40.94%,其次为β-折叠25.50%,p-转角5.37%和无规则卷曲28.19%。子偏爱性浅析结果显示,无乳链球菌cpsE基因偏爱GCA等23个子,与大肠杆菌、酵母和人的子利用偏爱性差别较大的分别有20、18和24个；稀有子浅析显示,cpsE基因开放阅读框的子利用情况与大肠杆菌无显著差别。2.无乳链球菌cpsE基因的原核表达和多克隆抗体的制备构建重组表达质粒pET-32a(+)-cpsE,并转入大肠杆菌BL21(DE3)进行原核表达,再利用SDS-PAGE. Western-blot及琼脂扩散试验对重组蛋白的免疫原性进行探讨。结果显示,利用IPTG为表达诱导剂,在菌体经超声波破碎处理的沉淀成分中可检测到一种大小约36KDa的蛋白,与cpsE基因表达产物的预期大小相吻合。对表达条件进行优化后显示,最佳表达条件为0.2mM的IPTG在37℃下诱导3h。利用重组表达蛋白所带的6×His标签利用亲和层析的策略对其进行纯化,能获取较高纯度的重组蛋白。将过柱纯化的重组蛋白免疫家兔,制备了兔的高免血清。经VVestern-blot和琼脂扩散试验检测结果表示,CpsE重组蛋白具有良好的免疫原性,制备的兔抗CpsE重组蛋白多克隆抗体的免疫效价达1：32。3.基于cpsE基因的间接原位PCR策略的建立与运用通过腹腔注射无乳链球菌分离株活菌液、无乳链球菌标准菌株活菌液和生理盐水的方式,制备小鼠人工感染阳性对照样品、待检样品和阴性对照样品。以无乳链球菌cpsE基因为模板设计特异性引物和寡核苷酸探针,运用于已制备的阳性对照样品和阴性对照样品上进行间接原位PCR策略的构建,并以建立的间接原位PCR策略检测待检样品,探讨无乳链球菌分离株在小鼠体内组织的分布规律。结果表明,人工感染4h时,在小鼠的肝脏和肾脏检测到少量的阳性信号；人工感染后8h时,在小鼠的脾脏和肺脏也开始检测到阳性信号；人工感染后12h时,在小鼠的胃和肠部位也检测到强阳性信号；人工感染后24h和36h时,在小鼠的肝脏、脾脏、肾脏、脑、肠和肺脏都可检测到大量阳性信号分布,但心肌中始终只有少量阳性信号分布。关键词：无乳链球菌论文cpsE基因论文克隆论文分子特性论文原核表达论文间接原位PCR论文

中文摘要7-9

ABSTRACT9-11

符号说明11-12

第一部分文献综述及选题目的和作用12-21

第一节无乳链球菌的探讨进展12-20

1. 无乳链球菌的分类及生物学特性12

2. 无乳链球菌的特点结构12-13

3. 无乳链球菌的致病性13-14

3.1 对水产动物的致病性13-14

3.2 对人的致病性14

4. 无乳链球菌的致病机制14-15

5. 无乳链球菌的毒力因子15-20

5.1 多糖类15-18

5.1.1 荚膜多糖寡糖重复单位的结构16-17

5.1.2 荚膜多糖的合成17

5.1.3 荚膜多糖合成相关基因17-18

5.2 肽聚糖18

5.3 脂磷壁酸18

5.4 溶血素18-19

5.5 表面蛋白19-20

5.5.1 Alp蛋白家族19

5.5.2 β蛋白19

5.5.3 C5a肽酶19-20

5.5.4 Lmb蛋白20

5.5.5 Sip蛋白20

5.5.6 FbsA蛋白20

第二节选题的目的与作用20-21

第二部分试验探讨21-74

第一节无乳链球菌cpsE基因的分子特性浅析21-39

1. 材料与策略22-23

1.1 材料22

1.1.1 菌株22

1.1.2 主要生物信息学浅析软件22

1.2 策略22-23

1.2.1 核酸序列的分子特性浅析22

1.2.2 蛋白质序列的分子特性浅析22-23

2. 结果23-36

2.1 核酸序列的分子特性浅析23

2.2 蛋白质序列的分子特性浅析23-31

2.3 无乳链球菌cpsE的子偏爱性浅析31-35

2.4 无乳链球菌cpsE基因稀有子35-36

3. 讨论36-39

3.1 生物信息学的运用36-37

3.2 cpsE基因的分子特性浅析37-38

3.3 子偏爱性对蛋白表达的影响38-39

第二节无乳链球菌cpsE基因的原核表达及多克隆抗体制备39-63

1. 材料39-43

1.1 菌株/载体39-40

1.2 实验动物40

1.3 主要试剂40-41

1.4 主要溶液配制41-43

1.4.1 琼脂糖凝胶电泳所用溶液41

1.4.2 细菌培养相关溶液41

1.4.3 SDS-PAGE电泳相关溶液41-42

1.4.4 分离His标签重组蛋白包涵体溶液42-43

1.4.5 Western-blot相关溶液43

1.5 主要仪器设备43

2. 实验策略43-51

2.1 无乳链球菌cpsE基因的扩增43-44

2.1.1 引物设计43-44

2.1.2 cpsE基因的PCR扩增44

2.2 cpsE基因的T克隆与鉴定44-47

2.2.1 cpsE基因的T克隆构建路线(图6)44-45

2.2.2 cpsE基因的T克隆45-46

2.2.3 重组克隆质粒的鉴定46-47

2.3 cpsE基因重组质粒表达菌株的构建47-49

2.3.1 cpsE表达质粒的构建(图7)47-48

2.3.2 重组克隆质粒pMD19-T-cpsE及表达质粒pET-32a(+)的提取、酶切与回收48

2.3.3 酶切回收产物pET-32a(+)与cpsE基因片段的连接48

2.3.4 重组表达质粒转化感受态细胞DH5a48-49

2.3.5 转化菌落的鉴定49

2.4 重组蛋白的诱导表达及条件优化49-50

2.4.1 重组蛋白在菌体中的分布及诱导温度的优化49

2.4.2 IPTG浓度优化49

2.4.3 诱导时间的优化49-50

2.5 重组蛋白的纯化50

2.5.1 包涵体的洗涤50

2.5.2 过柱纯化重组蛋白50

2.6 兔抗CpsE多克隆抗体的制备50-51

2.6.1 免疫家兔计划50-51

2.6.2 Western-blot检测抗体特异性51

2.7 琼脂扩散试验检测兔抗CpsE抗体效价51

2.8 兔抗CpsE IgG的纯化及鉴定51

2.8.1 粗提兔抗CpsE的IgG51

3. 结果51-59

3.1 cpsE基因的扩增和T克隆鉴定51-53

3.2 重组表达质粒pET-32a(+)-cpsE鉴定53-54

3.3 重组蛋白表达条件的优化54-57

3.3.1 重组蛋白表达的分布及诱导温度优化54-55

3.3.2 IPTG浓度的优化55-56

3.3.3 诱导时间的优化56-57

3.4 重组蛋白的纯化57-58

3.5 免疫兔血清的Western-blot检测58

3.6 兔抗CpsE血清琼脂扩散试验效价的检测58-59

4. 讨论59-63

4.1 cpsE基因引物设计和T克隆59

4.2 外源基因的融合表达59-61

4.3 诱导表达条件的优化61

4.4 包涵体的形成61-62

4.5 抗血清的制备及纯化62-63

第三节无乳链球菌在小鼠组织器官的分布规律探讨63-74

1. 实验材料63-66

1.1 试验用菌株63

1.2 试验动物63

1.3 主要试剂63

1.4 主要仪器63-64

1.5 相关溶液配制64-66

1.5.1 储备液64-65

1.5.2 预杂交液65-66

1.5.3 杂交液66

1.5.4 BCIP/NBT显色液66

2. 实验策略66-70

2.1 菌株的复苏和稀释66

2.2 人工感染和样品收集66-67

2.3 引物及特异性探针的设计和合成67-68

2.4 稀释探针68

2.5 间接原位PCR策略的建立68-70

2.5.1 切片68

2.5.2 预处理68

2.5.3 原位扩增68-69

2.5.4 原位杂交的反应条件优化69

2.5.5 原位杂交69-70

2.5.6 杂交后洗涤70

2.5.7 封闭和特化处理70

2.5.8 显色70

2.6 结果判定70

3. 结果与浅析70-72

4. 讨论72-74

4.1 间接原位PCR的运用72-73

4.2 无乳链球菌在小鼠体内的分布73-74

附图及说明74-79

链球菌无乳链球菌cpsE基因克隆、原核表达和多克隆抗体制备与其在原位PCR中运用查抄袭率怎么

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