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阐述分光吖啶酯类底物合成与其在对氧磷酶活性测定中运用

收藏本文 2024-03-20 点赞:13251 浏览:49955 作者:网友投稿原创标记本站原创

摘要:肿瘤是危及人们生命的“杀手”之一,由此及早的发现和治疗是非常重要的,但由于肿瘤早期的症状不是很显著,容易出现误诊和漏诊等不足。通常在肿瘤发生的4-8周前,血清或体液中的对氧磷酶的活性会显著增加或减少,由此,测定体液中的对氧磷酶(PON)的活性是诊断肿瘤的重要手段之一。测定对氧磷酶活性的策略有多种,但由于干扰因素和灵敏度的不足,能用于体液样品的测定策略却很少。目前文献多以紫外吸收光谱法测定酶的活性,该策略简单,但背景噪音大,并且生物体是一个极其复杂的系统,酶提取液中含有的其它吸光成分较多,紫外-可见分光光度法测定专一性不强,灵敏度也不高。而化学发光法不需要光源,背景噪音小,干扰少,测量时灵敏度高,用于测定酶的活性不需要对具有紫外吸收的干扰物进行分离。在本论文中,合成了三个吖啶酯类底物,以9-(4-对氯苯氧羰基)-10-吖啶三氟磺酸盐(CPOCMA)为探讨对象,采取化学发光法来测定血清中对氧磷酶的活性。底物CPOCMA是由发光基团和离去基团组成的。通过对其发光性能的探讨发现,CPOCMA的化学发光属于瞬间发光,整个发光历程在20s内即可完成;引发剂可以影响CPOCMA的发光强度,当在0.1%H_2O_2与0.025mol/L HNO3和1.0mol/L NaOH与1.0×10~(-3)mol/L CTAB的情况下,吖啶酯类底物的发光强度最大;吖啶酯类底物储有着2℃和25℃时,随着溶液的pH(6,7,8)的增大,试剂的稳定性变差。通过对CPOCMA的发光性能的探讨,将其作为化学发光法测定血清中PON的活性的发光底物,对底物的特异性、策略的可靠性进行了探讨。探讨发现:化学发光的底物CPOCMA具有高效的化学发光效率,其浓度比紫外法测定PON活性的底物乙酰苯酯和二嗪农的浓度至少低1.0×10-5倍,且CPOCMA的用量少,成本低。此外,化学发光法测定PON的活性在生理的pH下就可完成。血清中的PON和人对氧磷酶催化CPOCMA水解的米氏常数(Km)分别为85nmol/L和83nmol/L,且二者很接近,这可能是受血清中其他酯酶的影响所致,例如脂肪酶和乙酰胆碱酯酶。激动剂氯化钠和氯化钙都可以提升rHuPON和血清中PON的活性,但是对血清中的乙酰胆碱酯酶和脂肪酶的活性没有影响,且在加入PON的激动剂氯化钙时,PON的活性是乙酰胆碱酯酶和脂肪酶的7.8倍。由此,PON的激动剂的加入提升了底物的特异性和灵敏度。我们分别以CPOCMA和二嗪农、乙酰苯酯为底物,对30个血清样品进行探讨,通过化学发光法和紫外分光光度法两种策略的比较发现,30个血清样品在底物不同的情况下,血清中的PON所体现的催化作用的走势相同,个别样品有着差别,可能是由于PON的多态性引起的。由此可知,以CPOCMA为底物,通过化学发光法测定血清中的PON的活性的策略是可靠的。关键词:对氧磷酶论文吖啶酯论文底物论文化学发光论文紫外分光光度法论文

    摘要3-5

    ABSTRACT5-10

    1 绪论10-24

    1.1 对氧磷酶及其与疾病的联系10-15

    1.1.1 对氧磷酶的介绍10

    1.1.2 PON 的测定策略10-11

    1.1.3 PON 与疾病的联系11-13

    1.1.4 影响 PON 活性的因素13

    1.1.5 PON 的底物13-15

    1.2 化学发光15-23

    1.2.1 化学发光反应的基本原理16-17

    1.2.2 化学发光反应系统17-21

    1.2.3 化学发光联用技术21-22

    1.2.4 化学发光的运用和探讨进展22-23

    1.3 吖啶酯衍生物23

    1.4 本课题探讨的目的及内容23-24

    2 吖啶酯类底物的合成24-28

    2.1 引言24

    2.2 实验部分24-25

    2.2.1 仪器与试剂24

    2.2.2 吖啶酯类底物的合成路线24-25

    2.3 实验策略25-27

    2.3.1 化合物 9-(4-对叔丁基苯氧羰基)-10-吖啶三氟磺酸盐的合成25-26

    2.3.2 化合物 9-(4-对氯苯氧羰基)-10-吖啶三氟磺酸盐的合成26

    2.3.3 化合物 9-(戊基苯氧羰基)-10-吖啶三氟磺酸盐的合成26-27

    2.4 结构表征27

    2.5 本章小结27-28

    3 吖啶酯类底物的化学发光性能的测试28-36

    3.1 引言28-29

    3.2 吖啶酯衍生物的发光机理29

    3.3 实验部分29-31

    3.3.1 仪器和试剂29-30

    3.3.2 实验储备液的配制30

    3.3.3 化学发光检测仪的参数30-31

    3.3.4 实验策略31

    3.4 结果与讨论31-34

    3.4.1 CPOCMA 发光系统的动力学曲线31-32

    3.4.2 发光引发剂及表面活性剂对 CPOCMA 发光强度的影响32-34

    3.4.3 CPOCMA 发光系统的稳定性34

    3.5 本章小结34-36

    4 吖啶酯类底物在对氧磷酶活性测定中的运用36-51

    4.1 引言36-37

    4.2 实验部分37-38

    4.2.1 主要仪器和试剂37

    4.2.2 实验储备液的配制37

    4.2.3 化学发光检测仪的参数37

    4.2.4 化学发光测定策略37-38

    4.2.5 PON 活性的测定策略38

    4.3 结果与讨论38-50

    4.3.1 以吖啶酯为底物测定 PON 的活性的 pH 的优化38-39

    4.3.2 温度对 PON 催化水解 CPOCMA 的影响39-40

    4.3.3 标准人对氧磷酶催化 CPOCMA 水解的反应动力学方程40-41

    4.3.4 血清中 PON 催化 CPOCMA 水解的反应动力学方程41

    4.3.5 反应速率常数的测定41-43

    4.3.6 添加 PON 的激动剂改善血清中 PON 催化 CPOCMA 水解43-45

    4.3.7 干扰实验45-48

    4.3.8 血清催化 CPOCMA 水解的线性联系48-49

    4.3.9 化学发光法测定对氧磷酶催化 CPOCMA 水解策略的验证49-50

    4.3.10 变异系数的测定50

    4.4 本章小结50-51

    5 结论与展望51-53

    5.1 结论51-52

    5.2 后续工作和展望52-53

    致谢53-54

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