摘要:S-腺苷蛋氨酸(S-adenosylmethionine,SAM)和谷胱甘肽(Glutathione,GSH)是生物体内两种重要的含硫生物活性小分子化合物。SAM在临床上常用于肝病、关节炎和抑郁症的治疗。GSH作为生物体内最重要的活性巯基化合物,具有提升机体免疫力和抗氧化等功能。SAM和GSH分别在医药、食品、化妆品和保健品等领域有着广泛的运用。酵母发酵法被认为是SAM和GSH生物合成的最有潜力的策略。SAM与GSH的合成均需要能量的参与,在SAM与GSH生物合成历程中,能量代谢与物质代谢一样,在其发酵历程中占有重要地位。其中,ATP作为限制性底物和能量物质,其含量的高低更是决定着底物的转化效率以及SAM和GSH能否高效合成。本论文以Candida utips CCTCC M209298生物合成SAM和GSH历程中胞内能量代谢规律为指导,以实现SAM和GSH联合高产为目标,以胞内ATP的有效利用和外源性能量辅助物质添加以增加胞内ATP的供给等两个方面入手,对SAM和GSH的发酵联产情况进行探讨,主要结果如下:(1)探讨了与SAM和GSH合成密切相关的10种氨基酸对C. utips CCTCC M209298细胞生长和产物合成的影响,发现L-蛋氨酸和L-半胱氨酸对SAM和GSH的合成影响最为显著。分批培养结果表明,L-蛋氨酸和L-半胱氨酸最适添加浓度分别为6g/L和6mmol/L。浅析了分批培养时C. utips CCTCC M209298胞内ATP代谢规律,提出以胞内ATP代谢规律为指导的两阶段氨基酸添加对策,即在发酵0h一次性添加6g/L L-蛋氨酸,发酵21h一次性添加6mmol/L L-半胱氨酸,实现了对发酵中后期胞内ATP的充分利用,最终SAM和GSH联产总量达669.3mg/L,比对照提升了124.6%。(2)在摇瓶发酵条件下考察了柠檬酸钠对SAM和GSH合成的影响,发现柠檬酸钠对SAM和GSH的合成均有一定的推动作用,且低浓度柠檬酸钠(如2g/L)有利于GSH的合成,而高浓度柠檬酸钠(如10g/L)对SAM的推动作用更为显著。采取响应面浅析法对柠檬酸钠添加浓度及其添加时间进行优化,模型预测和验证实验结果均表明在联产发酵6h时一次性添加10g/L柠檬酸钠的效果最佳。考虑到柠檬酸钠的碱化作用,进一步在发酵罐中考察了柠檬酸钠对SAM和GSH联产的影响,结果表明在发酵15h时一次性添加2g/L柠檬酸钠的添加方式最佳,在此添加方式下,SAM和GSH联产总量达663.9mg/L,比对照提升了27.5%。通过对SAM和GSH分批发酵历程进行浅析,发现在发酵后期柠檬酸钠的添加显著提升了胞内NADH和ATP的水平(与对照相比),同时柠檬酸钠能够提升S-腺苷蛋氨酸合成酶和异柠檬酸脱氢酶的活性,抑制己糖激酶的活性。(3)利用恒化培养手段对SAM和GSH生物合成的培养条件进行优化,获得了细胞生长期有利于SAM和GSH高效合成的环境条件,即28℃、pH4.5和400r/min。据此,提出了分批培养两阶段环境条件制约对策,结果SAM与GSH联产总量达607.0mg/L,比对照提升了13.3%。将此对策与L-半胱氨酸添加对策、柠檬酸钠添加对策相结合,使得SAM和GSH的联产总量有了进一步提升,为751.3mg/L,GSH胞内含量达3.09%,SAM胞内含量亦达到2.75%。关键词:产朊检测丝酵母论文S-腺苷蛋氨酸论文谷胱甘肽论文ATP论文柠檬酸钠论文
中文摘要4-6
Abstract6-11
第一章 文献综述11-26
1.1 S-腺苷蛋氨酸11-14
1.1.1 SAM 的理化性质11
1.1.2 SAM 的运用11-12
1.1.3 SAM 的生产策略12-14
1.2 谷胱甘肽14-19
1.2.1 GSH 的理化性质14-15
1.2.2 GSH 的运用15-16
1.2.3 GSH 的生产策略16-19
1.3 SAM 和 GSH 的代谢途径及发酵联产19-22
1.3.1 SAM 的代谢途径19-20
1.3.2 GSH 的代谢途径20-21
1.3.3 SAM 和 GSH 共同的代谢途径及发酵联产21-22
1.4 基于能量代谢调控的发酵历程优化22-24
1.4.1 胞内 ATP 水平的调控及其运用22-23
1.4.2 胞内 NADH 水平的调控及其运用23-24
1.5 本论文的探讨作用及主要内容24-26
1.5.1 探讨作用24
1.5.2 主要探讨内容24-26
第二章 基于胞内 ATP 代谢浅析的氨基酸添加对策26-38
2.1 引言26
2.2 材料与策略26-28
2.2.1 菌种26
2.2.2 培养基26
2.2.3 培养策略26-27
2.2.4 浅析策略27-28
2.2.5 发酵动力学参数计算28
2.2.6 代谢通量计算及浅析28
2.3 结果与讨论28-37
2.3.1 氨基酸对 SAM 和 GSH 生物合成的影响28-29
2.3.2 SAM 和 GSH 分批发酵历程29-30
2.3.3 L-蛋氨酸对 SAM 和 GSH 分批发酵影响30-31
2.3.4 L-半胱氨酸添加浓度的确定31-32
2.3.5 基于胞内 ATP 代谢浅析的 SAM 和 GSH 联合高产氨基酸添加对策32-35
2.3.6 发酵动力学浅析35
2.3.7 代谢通量浅析35-37
2.4 小结37-38
第三章 柠檬酸钠推动 SAM 和 GSH 联合高产探讨38-50
3.1 引言38
3.2 材料与策略38-40
3.2.1 菌种38
3.2.2 培养基38-39
3.2.3 培养策略39
3.2.4 浅析策略39
3.2.5 实验设计与数据处理39-40
3.3 结果与讨论40-49
3.3.1 柠檬酸钠对 SAM 和 GSH 联产的影响40-41
3.3.2 柠檬酸钠添加条件的优化41-42
3.3.3 柠檬酸钠推动 SAM 和 GSH 联合高产42-49
3.4 小结49-50
第四章 恒化培养技术在SAM 和GSH联合高产中的运用50-59
4.1 引言50
4.2 材料与策略50-51
4.2.1 菌种50-51
4.2.2 培养基51
4.2.3 培养策略51
4.2.4 浅析策略51
4.3 结果与讨论51-58
4.3.1 温度对 SAM 和 GSH 联产的影响51-52
4.3.2 pH 对 SAM 和 GSH 联产的影响52
4.3.3 搅拌转速对 SAM 和 GSH 联产的影响52-53
4.3.4 环境条件的两阶段制约对策53-55
4.3.5 基于胞内 ATP 调控的 SAM 和 GSH 联合高产对策55-58
4.4 小结58-59
总结与展望59-61