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摘要：目的脑膜是脑脊液循环的通路之一,脑膜纤维化是交通性脑积水的主要病理改变,脑膜纤维化主要有蛛网膜下腔出血(Subarachnoid hemorrhage,SAH)引起,也可由神经外科手术、头颅照射、中枢神经系统肿瘤和一些未知原因引起,软脑膜间皮细胞是组成脑膜纤维化的主要细胞成分,在脑膜纤维化中发挥着作用。研究,转化生长因子-β_1(tranorming growth factor-beta 1, TGF-β_1)是SAH后脑膜纤维化的主要细胞因子,结缔组织生长因子(connective tissue growth factor, CTGF)是TGF-β_1主要下游因子,介导其主要的负面效应。本研究人重组转化生长因子-β_1为刺激因子,建立脑膜纤维化的细胞模型,观察转化生长因子-β_1对大鼠软脑膜间皮细胞(rat leptomeningeal mesothepal cells, RLMCs)CTGF表达的影响。探讨TGF-β_1在中枢神经系统损伤后脑膜纤维化中的作用,为今后在神经系统中对脑膜纤维化的治疗寻求可能的靶点。方法1、体外培养软脑膜间皮细胞:用机械吹打法和2.5g/L胰酶轻消化法培养大鼠软脑膜间皮细胞,在培养中以倒置显微镜观察细胞形态变化;苏木素伊红(hematoxypn and eosin stain,HE)染色观察细胞形态;扫描电子显微镜(scanning electron microscope, SEM)观察细胞超微结构;免疫细胞化学法鉴定细胞。2、将体外培养的RLMCs分为4组:①0组:正常对照组;②1组:用含TGF-β_11ng/mL培养细胞;③2组:用含TGF-β_12ng/mL培养细胞;④3组:用含TGF-β_14ng/mL培养细胞;各组分别在TGF-β_1刺激6h,12h,24h后,逆转录-聚合酶链反应(reverse transcription ploymerase chain reaction,RT-PCR)方法测定结缔组织生长因子(connective tissue growth factor,CTGF)CTGFmRNA;蛋白免疫印迹(western blotting)测定结缔组织生长因子(connective tissue growth factor, CTGF)蛋白表达。结果1、细胞形态观察:倒置显微镜下分离培养的细胞为多角形,汇合时呈铺路石样排列;HE染色胞质呈淡红色,且着色均匀;SEM下见细胞表面大量的微绒毛;间接免疫荧光正常大鼠软脑膜间皮细胞FITC染色胞浆中见绿色荧光,呈阳性反应;免疫细胞化学细胞角蛋白、波形蛋白抗原阳性,第Ⅷ因子抗原和PBS空白对照呈阴性。2、TGF-β_1对CTGF通路的作用:(1)TGF-β_1与软脑膜间皮细胞CTGFmRNA的量效关系:在6h、12h、24hTGF-β_1处理1ng/mL组、2ng/mL组、4ng/mL组表达与对照组比较,差异有性(p0.001);各实验组间比较差异有性(p0.001),提示随TGF-β_1浓度增加,CTGFmRNA表达增强呈剂量依赖性;TGF-β_1与软脑膜间皮细胞CTGFmRNA的时效关系:TGF-β_1处理6h组、12h组、24h组CTGFmRNA表达增强,各实验组间比较差异有性(p均0.001),其中TGF-β_1处理12小时组CTGFmRNA表达最强。(2)western blotting:TGF-β_1与脑膜间皮细胞CTGF蛋白表达关系:正常对照组RLMCs和不同浓度的TGF-β_1刺激后均表达CTGF蛋白,对照组表达较弱,在TGF-β_1刺激12h后,CTGF蛋白表达量最高。在TGF-β_1刺激6h、12h、24h后,各组均浓度的增加而增加,在4ng/mLTGF-β_1刺激软脑膜间皮细胞后CTGF蛋白表达最高,呈剂量依赖性。1.机械吹打法和胰酶轻消化法是一种简单、高效、性高的分离软脑膜间皮细胞的方法,可用于研究。2.TGF-β_1能激活大鼠软脑膜间皮细胞中CTGF通路。3.TGF-β_1刺激RLMCs细胞的CTGF的mRNA和蛋白的表达,浓度的增加而更为。CTGF可能作为今后治疗神经系统疾病中抑制脑膜纤维化的靶点而加以研究。关键词：软脑膜间皮细胞论文脑膜纤维化论文原代细胞培养论文转化生长因子β_1论文结缔组织生长因子论文
中文摘要5-8
英文摘要8-12
前言12-15
与方法15-35
结果35-46
讨论46-58
58-60