葡萄糖氧化酶体外定向进化-turnitin论文查重

摘要：葡萄糖氧化酶是一种的分析用酶和工业用酶。本研究以黑曲霉葡萄糖氧化酶(Glucose Oxidase，GOD)基因为模板，error-prone PCR，向GOD基因引入突变位点，然后将PCR产物克隆到穿梭载体pPIC9k，并将含有GOD突变基因的重组质粒引入大肠杆菌DH5α中扩增，抽提质粒后将之酶切线性化再引入营养酵母Pichiapastoris GS115，建立突变文库，筛选高酶活的突变子。经过两轮error-prone PCR，从3000多个突变子中，筛选3株有酶活提高的突变株，成功地使葡萄糖氧化酶酶比活提高到原来酶比活的3-4倍。对于所得高酶比活突变子，主要选取高酶活突变株A137S和D401N／A574V研究，利用stopped flow对其酶动力学分析，同时还了其他酶学分析。突变株D401N／A574V的酶动力学常数K_m降至野生型的1／5，K_(cat)值提高至原来的近1.5倍；而突变株A137S的酶动力学常数K_m降至原来的1／2，K_(cat)值也提高至原来的1.5倍左右。酶学性质分析，筛选所得的突变株D401N／A574V和A137S具有良好的热稳定性和储存稳定性，与野生型相比大的损失，具有实际应用价值。由蛋白质结构分析和酶动力学常数分析可得，突变株D401N／A574V中401位氨基酸Asp位于底物区域，推测由Asp突变为Asn，可能使酶更易与底物葡萄糖，而K_m值也降幅；574位的Ala则位于FAD区。突变株A137S中，137位的残基由Ala突变为Ser，它离电子传递链Thr110-Trp111-Glu144-His165-Cys164十分接近，有可能提高了这条电子传递链的电子传递效率，但是这条电子传递链的存在还缺乏实验证据，有待于研究。而74位和57位的突变，离活性中心及功能结构域比较远，它们对于酶活力的影响相对比较小。关键词：葡萄糖氧化酶论文定向进化论文error-prone论文PCR论文突变论文stopped论文flow论文

摘要2-3

Abstract3-9

章引言9-22

1 黑曲霉葡萄糖氧化酶结构与功能研究9-15

1.1 概述9

1.2 黑曲霉葡萄糖氧化酶结构及活性中心的构成9-11

1.3 黑曲霉葡萄糖氧化酶的催化机理及反应机理11-14

1.4 葡萄糖氧化酶的应用14

1.5 结束语14-15

2 蛋白质定向进化的研究进展15-22

2.1 概述15

2.2 随机突变库的建立方法15-17

2.3 突变库的高通量筛选17-20

2.4 小结20-22

章葡萄糖氧化酶体外定向进化22-46

1 与方法23-32

1.1 23-27

1.1.1 菌株与质粒23-25

1.1.2 培养基25

1.1.3 试剂与25-27

1.2 实验方法27-32

1.2.1 大肠杆菌质粒的提取27

1.2.2 error-prone PCR扩增GOD基因27-28

1.2.3 突变文库的构建28-29

1.2.3.1 含有突变基因的质粒文库的构建28

1.2.3.2 感受态细胞的制备28

1.2.3.3 转化28

1.2.3.4 含有突变基因的 DNA的28

1.2.3.5 酵母的电转化和基因组的提取28-29

1.2.3.6 文库的筛选29

1.2.4 GOD定点突变体表达载体的构建29-30

1.2.5 蛋白质的诱导生成30

1.2.6 GOD活力的测定30

1.2.7 SDS-PAGE分析蛋白纯度及分子量30

1.2.8 蛋白质的纯化30-31

1.2.9 蛋白质的浓度测定31

1.2.10 GOD动力学的测定31-32

1.2.11 GOD其他酶学性质的测定32

2 结果32-44

2.1 pPIC9kGOD的构建32-33

2.2 质粒的酶切鉴定33

2.3 GOD在酵母中的表达33-34

2.4 GOD的纯化34-35

2.5 突变文库的筛选35-39

2.6 GOD的酶学性质分析39-42

2.6.1 酶比活及动力学性质分析39-40

2.6.2 突变株的热稳定性和储存稳定性分析40-42

2.7 定点突变克隆的构建及分析42-44

3 讨论44-46

3.1 文库的建立与筛选44

3.2 突变株酶活提高的可能原因44-46

章 46-47

葡萄糖氧化酶体外定向进化

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