摘要：近年来,感染嗜热古菌、细菌的高温病毒(嗜热菌嗜菌体)引起了越来越多科研工作者的关注。因为,它们可以作为一种模式系统来研究热液区生物的生物化学及分子生物学特性,它们还影响着生物地球化学和生态系统进化,包括营养循环、生物种群结构、生物分类、遗传转换、生物进化等。噬菌体的基因组很微小,但是却编码了自身复制所需的蛋白,如DNA包装蛋白、头尾连接蛋白、DNA复制蛋白、转录调控蛋白、裂解蛋白等。比较基因组学,可以大量的基因多样性数据,同时发现基因组之间非常的序列性。嗜热微生物在高温条件下仍然不失活性并正常生长的特性在基因工程、发酵工业、废水废料的厌氧处理以及矿产资源的开发利用上很大的应用价值。所以了解嗜热微生物的热适应性机理,极为现实的。本论文实验把来自北纬14.7510西经44.9774深海热液区采集的泥样接入2216E培养基,设计了60℃、65℃、70℃、75℃四个温度梯度,并噬菌斑的有无对样品处理后电镜观察。发现了三株烈性嗜热菌噬菌体,并选择其中一株长尾噬菌体研究。经过初步验证,其中一株可能是从未报道过的嗜热菌噬菌体。本实验嗜热菌噬菌体E2的全基因组测序结果中ORF7、ORF8、ORF9、ORF10、ORF11、ORF33、ORF34、ORF37、ORF38、ORF39的核苷酸序列及表达载体pGEX-4T-2上的的多克隆位点设计并合成含有酶切位点(BamH I和Xho I)的正反向引物,重组表达,测序正确后纯化到了目的蛋白,并制作了相应的蛋白抗体,从而实验以验证其基因的功能,以期了解噬菌体与宿主的蛋白互作关系。本论文对高温噬菌体E2的ORF8(头尾连接蛋白)了功能鉴定。E2的全基因组测序结果中ORF8的核苷酸序列在NCBI上的比对,预测其功能为噬菌体头尾连接蛋白。纯化到ORF8所表达的目的蛋白后,制备抗体,并ELISA检验了其效价。Western blot实验结果该蛋白在晚期表达,而后免疫电镜实验标记了其在噬菌体上的位置。初步证明了此蛋白确实在噬菌体E2的头尾连接处起作用。为了探索嗜热菌的热适应性机理,以近海温泉分离的Thermus thermophilus WL为,蛋白质组学研究。利用本实验室构建的超氧化物岐化酶缺失突变株测定突变株的生长曲线。结果,突变株与野生型菌株相比,最适生长温度由70℃下降至65℃,最高生长温度也下降了5℃,从80℃下降到75℃。为了找出超氧化物岐化酶缺失突变而导致的表达发生变化的其他蛋白,从而找出并研究与嗜热菌蛋白质热适应性有关的蛋白,了萤光差异双向电泳分析实验。在成功找到若干差异点后,打质谱鉴定,初步确定与嗜热菌蛋白质热适应性有关的蛋白。关键词：嗜热菌论文海洋嗜热细菌噬菌体论文噬菌体头尾连接蛋白论文嗜热菌蛋白热适应机理论文
摘要6-8
Abstract8-10
1 前言10-26
1.1 嗜热菌概述11-17
1.1.1 嗜热菌研究进展11-12
1.1.2 嗜热菌的生存环境12
1.1.3 嗜热菌的分类与鉴定12-14
1.1.4 嗜热菌的分离技术与方法14-15
1.1.5 嗜热菌的应用15-17
1.2 高温噬菌体概述17-21
1.2.1 高温噬菌体的研究现状17
1.2.2 高温噬菌体的基因组17-18
1.2.3 噬菌体的形态及分类18-20
1.2.4 高温噬菌体的分布20
1.2.5 高温病毒的研究及应用前景20
1.2.6 高温细菌噬菌体E2 的基本特征20-21
1.3 嗜热菌耐热性机理概述21-23
1.3.1 研究现状21-22
1.3.2 嗜热菌细胞膜的稳定性22
1.3.3 核酸的耐热性研究22-23
1.3.4 蛋白质的热稳定性23
1.4 本论文研究的内容和23-26
2 与方法26-48
2.1 26-35
2.2 基本方法35-48
3 结果与分析48-96
3.1 深海热液区嗜热菌噬菌体的分离筛选48-50
3.1.1 样品分离48
3.1.2 电镜观察噬菌体48-49
3.1.3 电镜下观察宿主49-50
3.2 E2 基因的表达50-79
3.2.1 EV7 的表达纯化50-53
3.2.2 EV9 的表达纯化53-57
3.2.3 EV10 的表达纯化57-60
3.2.4 EV11 的表达纯化60-63
3.2.5 EV33 的表达纯化63-67
3.2.6 EV34 的表达纯化67-70
3.2.7 EV37 的表达纯化70-73
3.2.8 EV38 的表达纯化73-76
3.2.9 EV39 的表达纯化76-79
3.3 噬菌体头尾连接蛋白（EV8 ）的研究79-85
3.3.1 EV8 序列分析79
3.3.2 EV8 基因的重组表达79-83
3.3.3 EV8 基因在噬菌体中的表达分析83-84
3.3.4 EV8 蛋白的定位分析84-85
3.4 嗜热菌Thermus thermophilus WL 蛋白质热适应性初步研究85-96
4 讨论96-98
5 小结与展望98-100
5.1 小结98-99
5.2 展望99-100
6 参考文献100-108
附录108-109
致谢109
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