本站原创1 材料与方法
1.1 材料
健康清洁雄性SD大鼠40只，8～12周龄，体质量250～300 g，由南方医科大学实验动物中心提供。实验前分笼饲养2周，自由摄取食水。盐酸戊乙奎醚（长托宁，批号100302，成都力思特制药股份有限公司），一抗试剂HMGB1、细胞外信号调节激酶（ERK1/2）、应激活化蛋白激酶（JNK/SAPK）和p38 MAPK、磷酸化ERK1/2 （p-ERK1/2）、p-JNK1/2、p-p38和二抗试剂辣根过氧化物酶标记物（美国Santa Cruz公司），ECL化学发光试剂盒（美国Amersham公司），Oligo（dT）12-18、M-mlV逆转录酶和Taq DNA聚合酶（美国Promega公司），RNA提取试剂（德国Boehringer Mannhein公司），髓过氧化物酶（MPO）试剂盒、考马斯亮蓝（南京建成生物工程研究所究），PCR引物由上海生工生物工程公司合成。1.2 大鼠VILI模型复制与分组
40只SD大鼠随机（随机数字法）分为5组（n=8），分别为对照组、机械通气组、机械通气+PHC 1.0 mg/kg、机械通气+PHC 0.5 mg/kg和机械通气+PHC 0.1 mg/kg组。麻醉大鼠，起效后行备皮、消毒，进行气管切开，将16G静脉穿刺留置导管插入气管以作气管导管用，接小动物呼吸机（型号683，美国Harvard Apparatus公司）行机械通气。机械通气参数设置为潮气量Vt=30 ml/kg、PEEP=0 mm Hg（1 mm Hg=0.133 kPa）、吸呼比1∶1，源于：论文格式模板下载www.udooo.com
调节呼吸频率（RR）在40～70之间，使PETCO2维持在35～45 mm Hg，通气时间为4 h。右颈总动脉置管测定动脉压，左股静脉置管用于输液和给药。监测动物血压、心率和心电图在正常范围内，用气体检测仪（美国Datex公司）监测PETCO2。对照组动物除不行机械通气外，其余操作同机械通气组。到预定时间后，放血处死。1.3 观察指标与测定方法
1.3.1 肺组织病理学改变 右上叶肺组织用10 %甲醛固定，经石蜡包埋切片、苏木精-伊红染色后，光镜观察病理学改变。1.3.2 肺组织湿/干质量比值（W/D） 取大鼠右肺中叶组织，称湿质量（W）后于干燥箱中80 ℃烤至恒质量并称干质量（D），计算肺W/D比值。
1.3.3 支气管肺泡灌洗液（BALF）中WBC计数和总蛋白含量测定 左肺行肺灌洗，回收后800 r/min离心10 min，沉淀物用PBS稀释后行瑞氏染色，光镜下行白细胞计数。BALF中总蛋白的测定采用考马斯亮蓝染色法。
1.3.4 肺组织MPO活性测定 肺组织MPO活性测定采用MPO试剂盒。
1.3.5 HMGB1 mRNA表达的测定 按Trizol一步法提取总RNA，逆转录合成cDNA。取逆转录产物进行PCR反应（94 ℃变性1 min，54 ℃复性1 min，72 ℃延伸1 min，30个循环）。HMGB1的扩增引物为：5’-ATG GGC AAA GGA GAT CCT A -3’和5’-ATT CAT CAT CAT CAT TCT TCT-3’；内对照GAPDH的扩增引物为：5’-CCC ATC ACC ATC TTC CAG GA-3’和5’-TGC TTC ACC ACC TTC TTG AT-3’。2 %琼脂糖凝胶电泳，采用凝胶成像系统（美国Kodak公司）采集图像并进行半定量分析，以HMGB1/GAPDH灰度比值表示各组HMGB1 mRNA的水平，各组实验重复3次。1.3.6 HMGB1蛋白表达和MAPK活性的测定 肺组织加入细胞裂解液后冰上匀浆，蛋白质定量采用Bradford法，样品加入2×SDS加样缓冲液，行SDS-PAGE凝胶分离，蛋白条带半干电转移到PVDF膜上。室温下用TTBS（100 mmol/L Tris-HCl，0.9% NaCl，0.1% 吐温-20）阻断1 h，先后分别用HMGB1、ERK1/2、p38、JNK1/2、p-ERK1/2、p-p38、p-JNK1/2的一抗和辣根过氧化物酶标记的二抗孵育，最后用增强化学发光法（ECL）检测阳性信号。采用凝胶成像分析系统进行半定量分析，以灰度比值表示各组HMGB1蛋白和MAPK磷酸化水平。
1.4 统计学方法
所得数据用均数±标准差（x±s）表示，应用SPSS 13.0软件处理。采用单因素方差分析进行不同组别间的比较，方差齐者组间比较用LSD-t检验，方差不齐者用Tamhane’s T2检验，以P<0.05为差异具有统计学意义。2 结果2.1 肺组织病理学改变
对照组大鼠肺组织结构完整、清晰，未见中性粒细胞渗出；机械通气组肺泡结构破坏明显、肺泡腔内大量炎性细胞浸润；与机械通气组比较，1.0 mg/kg PHC组肺组织病理改变明显减轻，肺泡结构较完整，肺泡腔内少量炎性细胞浸润，而0.5 mg/kg和0.1 mg/kg PHC组改变不显著，仍可见较为明显的炎性病理改变，见图1。2.2 总蛋白、W/D、白细胞计数和MPO
与对照组比较，机械通气组肺组织W/D、MPO和BALF中总蛋白、白细胞计数等均显著增加（P<0.05）；与机械通气组比较，1.0 mg/kg PHC组肺组织W/D、MPO和BALF中总蛋白、白细胞计数等均显著下降（P<0.05），而0.5 mg/kg和0.1 mg/kg PHC组上述指标的差异无统计学意义（P>0.05），见表1。2.3 肺组织HMGB1蛋白表达的变化
与对照组比较，机械通气组HMGB1蛋白的表达量显著增加（P<0.05）；与机械通气组比较，1.0 mg/kg PHC组HMGB1蛋白的表达量显著下降（P<0.05），而0.5 mg/kg和0.1 mg/kg PHC组HMGB1蛋白表达的差异无统计学意义（P>0.05）。见图2。2.4 肺组织HMGB1 mRNA表达的变化
图3显示，与对照组比较，机械通气组HMGB1 mRNA的表达量显著增加（P<0.05）。与机械通气组比较，1.0 mg/kg PHC组HMGB1 mRNA的表达量显著下降（P<0.05），而0.5 mg/kg和0.1 mg/kg PHC组HMGB1 mRNA表达的变化无统计学意义（P>0.05），这与HMGB1蛋白的表达变化一致。2.5 肺组织MAPK活性的变化
由于1.0 mg/kg PHC可明显抑制HMGB1蛋白和mRNA的表达，笔者选择该剂量的PHC观察对MAPK激酶活性的影响。对照组未见ERK1/2、JNK1/2和p38 MAPK的激活，机械通气组各激酶均明显激活，表现为ERK1/2、JNK1/2和p38 MAPK的磷酸化水平显著增加（P<0.05），而1.0 mg/kg PHC则明显抑制ERK1/2、JNK1/2和p38 MAPK的磷酸化激活（P<0.05），见图4。3 讨论
VILI是机械通气治疗常见而严重的并发症，作为一种炎症刺激，机械通气时产生的牵张应力通过激活多种效应细胞释放大量炎症介质，引起肺损伤[6-7]。本研究中，与对照组相比，大潮气量通气4 h后大鼠肺组织病理损伤严重，反映肺渗出增多和肺水肿程度的指标肺W/D比、总蛋白含量以及反映肺组织白细胞浸润的MPO活性和白细胞计数均明显增加，提示大鼠VILI模型复制成功。
PHC是新型选择性莨菪类药物，抗胆碱作用强而全面、不良反应少，在危重患者救治中有诸多优势，如改善微循环、调节自主神经功能、调整有效循环血量、提高细胞对缺血缺氧的耐受能力等[8]。目前，除用于有机磷农药中毒外，PHC的研究主要集中在感染性休克和内毒素性肺损伤的救治等方面，但国内外尚未见用于VILI防治的报道。本研究结果显示，PHC能降低肺组织水肿程度，减轻肺组织病理损伤，且显著改善了肺组织MPO活性、白细胞数量
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、肺W/D比和BALF中总蛋白含量等指标，说明PHC有效抑制了机械通气引起的肺通透性增强、肺水肿形成和白细胞浸润，对VILI具有一定的保护作用。HMGB1是高迁移率族蛋白超家族成员，是广泛存在于真核细胞核中最重要的非组蛋白之一，其相对分子质量小，含量丰富，序列高度保守[9]。近年研究发现，HMGB1作为“晚期”炎症介质参与脓毒症和急性肺损伤的发病过程[10-11]。脂多糖和炎性因子可促进HMGB1的释放，释放入血的HMGB1则进一步诱生炎性介质和HMGB1自身的释放，引发炎症级联反应，提示HMGB1在炎症网络中可能是一个中心环节。笔者前期通过建立体外肺泡巨噬细胞牵张模型，发现机械牵张可以显著增加HMGB1蛋白的表达[12]。本研究应用RT-PCR和Western blot技术，进一步证实大潮气量机械通气（Vt=30 ml/kg）可以在基因和蛋白水平诱导大鼠肺组织HMGB1的表达。有研究报道PHC可抑制肿瘤坏死因子-α（TNF-α ）等炎症因子的表达与释放，但其对HMGB1的作用尚未阐明[13]。本研究首次观察到PHC可以抑制机械牵张诱导的HMGB1表达增加，提示PHC的肺保护机制可能与其减少HMGB1的表达有关。
己证实MAPK信号通路在介导细胞外应激引起的细胞反应中起重要作用[14]。MAPK家族主要包括ERK1/2、JNK/SAPK和p38 MAPK。不同的MAPK级联通路之间存在着交叉和整合作用，构成复杂的网络系统，ERK、JNK/SAPK和P38 MAPK三者的动态平衡决定了细胞的存活或凋亡。本研究显示，机械通气时ERK1/2、JNK1/2和p38 MAPK均被激活，而应用PHC可不同程度地抑制ERK1/2、JNK1/2和p38 MAPK的激活。提示PHC对VILI时HMGB1表达的拮抗效应可能与其抑制ERK1/2、JNK/SAPK和p38 MAPK通路的活化有关。本实验中1.0 mg/kg PHC可抑制HMGB1表达及MAPK信号通路的激活，提示较大剂量PHC可能通过抑制MAPK信号通路而减少HMGB1表达，进而减轻中性粒细胞的浸润，发挥抗炎作用。综上所述，本实验证实PHC可有效减轻VILI，对肺组织具有一定的保护作用，这种效应可能与其抑制MAPK通路激活并下调HMGB1的表达有关。参考文献
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（收稿日期：2012-11-19）
（本文编辑：何小军）
DOI：10.3760/cma.j.issn.1671-028
2.2013.04.013
基金项目：国家自然科学基金面上项目（81272136）；广东省科技计划项目（2010B031600011）；广州市科技计划重点项目（2012J4100034）；广州市医药卫生科技重点项目（20121A021001）作者单位：510180 广州，广州市第一人民医院麻醉科
通信作者：丁宁，Email： dingninggz@hotmail.com
P400-P403