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摘要：同源结构域Nkx6.2是由同源盒基因Nkx6.2编码产生。它作为一种反式作用因子,在中枢神经系统(central nervous system.CNS)胚胎期神经母细胞特化和生后期少突胶质细胞特化、成熟及髓鞘形成历程中,都发挥重要的调控作用。本课题组在前期探讨中发现,脑发育时期甲状腺激素(thyroid hormone, TH)不足会造成CNS内重要神经细胞异常,同时伴随Nkx6.2低表达。然而,在因TH不足而导致的脑发育迟滞病理历程中,转录因子Nkx6.2具体的参与机制还不明确。通过给予甲状腺功能减低模型外源性Nkx6.2的策略,将有助于解决或部分解决这一不足。转变基因表达水平的传统对策是基因转染,此技术有着插入诱变的风险。与之相比,直接转导目的蛋白内化进入细胞的策略,不仅可以避开这种风险,并且不会影响转导细胞的基因组表型。由此,本论文将TAT蛋白转导域(protein transduction domain.核定位信号(nuclear location sequence. NLS)一起与Nkx6.2融合表达。首先,提取大鼠脑组织的总RNA,逆转合成cDNA后,通过PCR扩增获得大鼠Nkx6.2编码基因的外显子序列。同时,利用化学合成策略获得TAT、NLS的编码序列。然后,将以上目的基因插入融合型原核表达载体pQE-30Xa,构建重组表达质粒pQE-30Xa/TAT-NLS-Nkx6.2(以下简称TN-Nkx6.2)。之后将其转化入E. cop M15[pREP4]进行融合表达,最终获得具有细胞渗透性的融合蛋白TN-Nkx6.2。表达产物经Ni2+-IDA亲和层析纯化后,标记荧光染料Cy7-N-羟基琥珀酰亚胺酯(Cy7-N-hydroxysuccinimide ester. Cy7NHS)经尾静脉向小鼠注射Cy7-TN-Nkx6.2后,运用活体荧光成像系统监测融合蛋白在脑部的动态分布,结果表明,融合蛋白能够通过血脑屏障(blood-brain barrier.BBB)到达脑组织；免疫荧光组化实验证明融合蛋白内化进入神经细胞胞浆、胞核；同时,该融合蛋白在短期内并未对脑组织细胞体现出显著的生物毒性。关键词：转录因子论文蛋白转导论文融合表达论文亲和层析论文活体荧光成像论文
中文摘要4-5
Abstract5-7
缩略语/符号说明7-9
前言9-13
探讨近况、成果9-12
探讨目的、策略12-13
一、重组蛋白TN-Nkx6.2的克隆及表达13-50
1 对象和策略13-34
2 结果34-43
3 讨论43-49
4 小结49-50
二、重组蛋白TN-Nkx6.2脑中分布的初步鉴定50-59
1 对象和策略50-53
2 结果53-56
3 讨论56-58
4 小结58-59
结论59-60