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摘要：钠泵(Na~+/K~+-ATPase)是哺乳类生物细胞膜上普遍有着的一种介导离子转运的跨膜载体蛋白，它由α、β、γ三个亚单位组成，其中α亚基具有酶的活性。α亚基有α1、α2、α3、α4四种亚型，各个亚型的基本结构高度保守，都有10个跨膜区即M1-M10。其膜外区序列含有多种钠泵调节因子的结合位点，包括内源性钠泵抑制剂—哇巴因的结合位点。目前认为，α亚基的第二个跨膜区M3-M4是哇巴因的一个重要结合位点。哇巴因与钠泵结合后，抑制钠泵活性，进而促使血压升高。由此，本探讨将以噬菌体随机肽库中筛选钠泵α1亚基M3-M4膜外区特异性结合肽，通过此结合肽来封闭哇巴因M3-M4结合位点，竞争抑制哇巴因与钠泵的结合，并通过检测此钠泵结合肽对内皮细胞和SHR大鼠血压的作用，进一步探讨钠泵与其抑制因子的可能作用机制，为高血压的治疗提供论述和实验依据。一、钠泵α1亚基M3-M4膜外区结合肽的筛选目的：以钠泵α1亚基M3-M4膜外区蛋白为靶标，以噬菌体随机12肽库中筛选出能与之特异性结合的多肽，以拮抗哇巴因对钠泵的抑制作用，并检测此特异性结合短肽与哇巴因是否竞争抑制联系。策略：(1)以钠泵α1亚基M3-M4膜外区序列(ILEYTWLEAGGGS)为靶蛋白，利用噬菌体随机12肽库技术，通过3轮“吸附—洗脱—扩增”的淘选，使与靶蛋白特异性结合的噬菌体得到大量富集。(2)双夹心ELISA实验鉴定噬菌体阳性克隆：以钠泵α1亚基M3-M4膜外区序列(ILEYTWLEAGGGS)包被ELISA板，同时设阴性对照，加入随机挑选的30个噬菌体原种上清，加HRP-抗M-13抗体，显色后于420nm测定OD值。(3)浓度依赖性实验：以钠泵α1亚基M3-M4膜外区序列(ILEYTWLEAGGGS)为靶蛋白，每个待鉴定克隆包被8个孔，将噬菌体克隆扩增后测定滴度，加入~10~(12)pfu的噬菌体并进行5倍系列稀释，加入HRP-抗M-13抗体，显色后测定OD值，以稀释倍数对吸光度作图。(4)噬菌体ssDNA的提取及序列浅析：采取M13噬菌体ssDNA快速提取试剂盒提取噬菌体ssDNA，测序后，根据“随机十二肽-gIII融合蛋白的N末端序列”，确定插入片段的基因序列，参照“遗传表”翻译出筛选多肽序列。(5)哇巴因竞争性抑制试验：将待鉴定的噬菌体上清进行2倍系列稀释，各取50μL与50μL100μg/mL哇巴因混匀，放入已包被靶蛋白的酶联板中，同时设阴性对照，加入HRP-抗M-13抗体，显色后测定OD值，以稀释倍数对吸光度作图。结果：(1)噬菌体随机12肽库筛选结果：3轮生物筛选中，阳性噬菌体的产出与投入比率逐轮提升，表明筛选出的噬菌体得到了选择性的富集。(2)双夹心ELISA实验：随机挑选的30个噬菌体克隆中21个样品孔与阴性对照孔OD比值≥2.1，确定为阳性克隆。(3)浓度依赖性实验：以稀释倍数对吸光度的图中看出，21个阳性克隆均具有浓度依赖性，提示有较好的亲和力。(4)噬菌体ssDNA的提取及序列浅析：提取21个噬菌体克隆的ssDNA，进行1%琼脂糖凝胶电泳，结果显示，目的条带7500bp左右与噬菌体DNA大小相符。测序结果表明，21个阳性噬菌体包含3种结合短肽，分别为肽A：SWYQEGPSTQPE一致率达47.6%(10/21)。肽B：SSNTAWQNMTSL一致率为28.6%(6/21)。肽C：GENPWENVAM一致率为23.8%(5/21)，合成肽A作为钠泵结合肽。(5)哇巴因竞争性抑制实验：结果表明，相同浓度的噬菌体上清，在哇巴因有着的情况下，其OD值比阴性对照降低；随着噬菌体上清中结合肽浓度的降低，其对哇巴因与靶蛋白结合的竞争力亦逐渐降低，说明结合肽与哇巴因是竞争抑制联系，筛选到的结合肽能够特异性地与钠泵α1亚基M3-M4膜外区的表位识别位点结合。结论：以钠泵α1亚基M3-M4膜外区序列(ILEYTWLEAGGGS)为靶蛋白，以噬菌体随机十二肽库中成功获得了能够与之特异性结合的多肽(SWYQEGPSTQPE)。为进一步探讨钠泵与哇巴因的作用机制及高血压的治疗奠定了基础。二、钠泵结合肽的生物学活性浅析目的：检测钠泵结合肽对哇巴因刺激血管内皮细胞增殖或凋亡的影响，并检测钠泵结合肽对自发性高血压大鼠(SHR)血压的影响，探讨该钠泵结合肽在高血压病治疗中的运用价值。策略：(1) MTT法检测钠泵结合肽对生理浓度的哇巴因刺激EA.hy926血管内皮细胞增殖的影响：取96孔板各组细胞，分别加入生理浓度(0.3×10~(-9)，0.6×10~(-9)，0.9×10~(-9)mol/L)的哇巴因及10~(-6)mol/L的钠泵结合肽，以不加钠泵结合肽组为阴性对照。培养24、48、72h后，加20μL MTT，继续培养4h后，弃上清，加入DMSO，于酶标仪测定570nm处吸光度值。(2)用流式细胞术检测钠泵结合肽对高浓度哇巴因刺激血管内皮细胞凋亡的影响：取完全贴壁的各瓶细胞，分别加入高浓度(10~(-4),10~(-6)mol/L)的哇巴因及10~(-4)mol/L的钠泵结合肽，以不加钠泵结合肽组为阴性对照。培养24h后，离心收集细胞，70%的冷乙醇固定，4℃冰箱存放。加入碘化丙啶(PI)染色30min后，用流式细胞仪检测细胞凋亡百分率。(3)钠泵结合肽对SHR大鼠血压的影响：给药组SHR大鼠尾静脉注射2mg/kg钠泵结合肽，于给药后15min，30min，45min，60min分别测量大鼠的血压值并记录，以注射生理盐水组为阴性对照。结果：(1) MTT法检测钠泵结合肽对生理浓度的哇巴因刺激EA.hy926血管内皮细胞增殖的影响：哇巴因浓度为0.6×10~(-9)mol/L时，对细胞有最大增殖作用(P0.05)，且在此基础上，加上钠泵结合肽后，细胞的增殖率较哇巴因单独有着时有所降低，24h、48h、72h分别降低10.24%、18.35%、16.18%。(2)用流式细胞仪检测钠泵结合肽对高浓度哇巴因刺激EA.hy926内皮细胞凋亡的影响：结果显示，高浓度哇巴因(10~(-4)mol/L、10~(-6)mol/L)均可刺激EA.hy926细胞发生凋亡，且具有显著性差别(P0.01)，当加入10~(-4)mol/L钠泵结合肽时，10~(-6)mol/L哇巴因组的细胞凋亡率显著下降(P0.01)。(3) SHR大鼠尾静脉注射2mg/kg钠泵结合肽后，其血压开始逐渐下降，到第15min血压出现最低值，由原来水平203.2±5.28mmHg降至179.8±4.83mmHg，较原水平降低11.5%，随后逐渐上升，到60min左右血压基本恢复到给药前水平。结论：筛选到的钠泵结合肽能够拮抗哇巴因对钠泵的结合，影响哇巴因诱导的血管内皮细胞增殖或凋亡，并且能够引起SHR大鼠血压下降，提示钠泵结合肽可作为降压药探讨的一个新方向。关键词：钠泵论文钠泵结合肽论文高血压论文噬菌体随机十二肽库论文哇巴因论文
摘要4-8
ABSTRACT8-13
引言13-15
第一部分 钠泵α1 亚基 M3-M4 膜外区结合肽的筛选15-41
前言15-16
材料与策略16-28
结果28-31
附图31-37
附表37-38
讨论38-39
小结39-40