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摘要：气道重塑是支气管哮喘（简称哮喘）的一个重要病理特点，但其具体发生机制尚不明确。整合素（Integrin）是一种由α、β亚单位组成的二聚体糖蛋白，能通过独特的信号传导途径调控细胞生长、分化、增殖、凋亡等多个生理历程。现已证实，Integrin-β1广泛有着于气道平滑肌细胞（AC）表面，并能调控AC多个重要的生理历程，故可能对哮喘气喘重塑有重要影响。本探讨通过构建靶向沉默小鼠Integrin-β1的shRNA表达载体，以体外、体内水平探讨Integrin-β1在哮喘气道重塑中的作用及其信号调控机制，以而确定哮喘治疗的新靶点。第一部分整合素-β1对哮喘气道重塑的影响目的探讨Integrin-β1对哮喘气道重塑的影响。策略设计并合成靶向小鼠Integrin-β1基因的shRNA表达载体，分别体外、体内转入哮喘小鼠模型AC，免疫荧光法检测体内外转染效率，RT-PCR及Real-time PCR法检测体外干预前后Integrin-β1mRNA表达变化；Western-blot法检测体外干预前后Integrin-β1蛋白表达变化；CCK-8法、BrdU ELISA法及流式细胞仪法检测体外干预前后AC增殖率及细胞周期分布时相的变化；Annexin V-PE/7-AAD双染法检测体外干预前后AC凋亡的变化；Transwell法检测体外干预前后AC迁移率的变化；ELISA法检测体外干预前后IL-6、IL-8的含量变化；肺组织病理切片观察体内干预前后哮喘小鼠模型气道重塑变化。结果shRNA表达载体能稳定转染哮喘小鼠AC，体外转染后的Integrin-β1的mRNA及其蛋白质水平均显著下调（P均0.05）；细胞增殖率减低（P0.05），G0/G1期细胞比例增加（P0.05），S期细胞比例降低（P0.05）；细胞凋亡率显著升高（P0.05）；此外，细胞迁移速率及IL-6、IL-8的含量则显著降低（P均0.05）；体内转染后的哮喘小鼠模型的气道重塑情况有所减轻。结论Integrin-β1能促使AC过度增殖、凋亡减缓、细胞迁移加速、炎症介质IL-6及IL-8分泌增加，引起气道平滑肌层增厚，是导致哮喘气道重塑形成的重要理由。第二部分整合素-β1在哮喘AC增殖信号网络中的作用及shRNA靶向干预探讨目的探讨Integrin-β1对小鼠慢性哮喘模型AC增殖信号网络的调控及shRNA靶向干预作用。策略构建靶向小鼠Integrin-β1基因的shRNA表达载体，体外转入哮喘小鼠模型AC，免疫荧光法检测体内外转染效率，RT-PCR及Real-time PCR法检测干预前后CycpnD1、c-Fos的mRNA表达变化；Western-blot法检测干预前后ERK1/2、STAT6、p-ERK1/2、p-STAT6、CycpnD1及c-Fos的蛋白表达变化；CCK-8法、BrdU ELISA法及流式细胞仪法检测干预前后AC增殖率及细胞周期时相分布的变化。结果shRNA表达载体稳定转染哮喘小鼠AC后，CycpnD1和c-Fos的mRNA及其相应蛋白质水平均显著下调（P均0.05），ERK1/2、STAT6蛋白表达未转变（P均0.05），p-ERK1/2蛋白表达降低（P0.05），而p-STAT6蛋白表达增高（P0.05）；体外转染后的细胞增殖率显著减低（P0.05），细胞周期阻滞在G0/G1时相中（P0.05）。结论哮喘AC内Integrin-β1/ERK1/2通路与IL-4/IL-13/STAT6通路间有着交互应答，而Integrin-β1能提升这两条通路的胞核内靶分子CycpnD1及c-Fos活性，可能是AC增殖信号网络的“分子开关”及影响哮喘气道重塑的作用机制所在；shRNA表达载体能靶向抑制Integrin-β1基因表达，可望成为哮喘气道重塑基因治疗的有效手段。关键词：哮喘论文AC论文气道重塑论文Integrin-β1论文shRNA表达载体论文哮喘论文AC论文Integrin-β1/ERK1/2通路论文IL-4/IL-13/STAT6通路论文shRNA靶向干预论文
摘要3-5
ABSTRACT5-9
前言9-18
第一部分 整合素-β1 对哮喘气道重塑的影响18-51
1 引言18
2 实验材料18-20
3 实验策略20-30
4 实验结果30-46
5 讨论46-51
第二部分 整合素-β1 在哮喘 AC 增殖信号网络中的作用及 shRNA 靶向干预探讨51-78
1 引言51
2 实验材料51-52
3 实验策略52-54
4 实验结果54-71
5 讨论71-78
结论78-79