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摘要：目的：探讨人白血病关蛋白16（Leukemia Related Protein16，LRP16）调控LPS/TLR4信号通路作用与制探讨。策略：(1).建抑制过表LRP16因3T3-L1稳定细系a.将3T3-L1细按80%密度接种于6cm培养皿中，24h后按ppofectamine2000说明书将pcDNA-3.1-16和pcDNA-3.1转染细，24h后更为含800μg/ml G418DMEM培养进行抗筛选3周，以后用含400μg/ml G418DMEM培养培养细，构建过表LRP16细系3T3-L1-16对照细系3T3-L1-3.1。用Western Blot法进行检验。b.针对已经筛选确定含有发卡结构LRP16因siRNA序列合Opgo DNA，退双链DNA，与pENTR/U6载体连接产生LV-siLRP16慢病毒载体，转化至感受态细DH5α，挑取重阳落进行PCR测序鉴定。将LV-siLRP16装系统质共转染293T细，产生慢病毒，运用Q-RCR检测病毒度。将慢病毒感染3T3-L1细后用4μg/ml杀瘟素(Blasticidin)进行抗筛选3周，以后用含2μg/ml BlasticidinDMEM培养培养细。构建抑制LRP16表细系3T3-L1-374对照细系3T3-L1-GFPi。用Western Blot法进行检验。(2). LRP16对3T3-L1脂细LPS/TLR4信号通路影响a.收不同浓度LPS刺激后4、8、12、24h细蛋白，Western Blot法检测LRP16蛋白表水平；b.抑制LRP16表细3T3-L1-374对照细3T3-L1-GFPi加入1μg/mlLPS刺激60min，用RT-PCR和Western Blot检测细TLR4、MyD88、IR-1和TRAF6mRNA蛋白表；c.Western Blot检测LRP16对无LPS刺激，上受体蛋白表；d. Western Blot法检测NF-κB蛋白表；e. ELISA法检测细培养上清中TNF-α、IL-6蛋白水平。(3). LRP16对LPS诱下MAPK信号通路影响用1μg/ml LPS刺激脂细60min，收细蛋白，Western blot检测抑制过表LRP16后，对ERK1/2、p38、JNK蛋白表影响。(4).LRP16对LPS诱下3T3-L1前脂细增殖影响a. MTT法绘制细增殖曲；b. Western blot检测过表抑制LRP16后Akt蛋白表变化。结果：(1).建抑制过表LRP16因3T3-L1稳定细系a.用SuperFect脂质体转染法分别质pcDNA3.1-LRP16和空白质pcDNA3.1转入3T3-L1细中，经G418筛选，稳定过表LRP16细株。采取Western blot技检测LRP16蛋白表情况，结果发现过表LRP16因细系（3T3-L1-16） LRP16蛋白含量约是对照细系（3T3-L1-3.1）目蛋白含量2.37倍(p0.05)。b.构建针对LRP16因shRNA慢病毒表载体，该病毒转染3T3-L1脂细后Blasticidin筛3周。荧光显微镜观察转染细显示慢病毒转染效率可80%-90%，Western blot检测显示抑制LRP16表细系（3T3-L1-374） LRP16蛋白减少至对照细系（3T3-L1-GFPi）40.6%(p0.01)。(2). LRP16对3T3-L1脂细LPS/TLR4信号通路影响a. LPS可影响LRP16蛋白表水平：LRP16蛋白表在LPS刺激后4h未发生显著变化，8h、12h剂量依赖增高，24h蛋白表剂量依赖降。b. RT-PCR结果显示：抑制LRP16表细3T3-L1-374中TLR4、MyD88、IR-1和TRAF6mRNA表水平，对于对照细3T3-L1-GFPi分别减少至58%、62.4%、60%和56%(P0.05)。Western Blot结果显示：抑制LRP16表细3T3-L1-374中TLR4和MyD88蛋白表对于对照细3T3-L1-GFPi分别减少至58.1%和60%(P0.05)，IR-1和TRAF6蛋白表减少至50%和42%，显于对照细(P0.01)。c.Western Blot结果显示：无LPS刺激，抑制LRP16表细3T3-L1-374中TLR4、MyD88、IR-1和TRAF6蛋白表较对照细3T3-L1-GFPi无显著变化(p＞0.05)。d.抑制LRP16表细3T3-L1-374中NF-κB核蛋白表对于对照细3T3-L1-GFPi减少至61%(P0.05)。e.培养上清中TNF-α、 IL-6蛋白含量减少至对照细65%和68%(P0.05)。(3). LRP16对LPS诱下MAPK信号通路影响Western Blot结果显示：过表LRP16细3T3-L1-16p-ERK1/2、p-p38和p-JNK较对照细3T3-L1-3.1显著增加(p＜0.01)；而抑制LRP16表细3T3-L1-374p-ERK1/2、p-p38和p-JNK，较对照细3T3-L1-GFPi显著减少(p＜0.01)。(4). LRP16对LPS诱前脂细增殖影响a.MTT结果显示：过表LRP16前脂细增殖较对照显著减。b.Western Blot结果显示：抑制LRP16表细3T3-L1-374p-serine-473Akt显著较对照细3T3-L1-GFPi增加；过表LRP16细3T3-L1-16p-serine-473Akt，显著较对照细3T3-L1-3.1减少。结论：(1).功构建了过表LRP16细系、抑制表LRP16细系对照细系，为后续实验探讨提供了稳定细模。(2).抑制LRP16因可断LPS/TLR4信号通路激活，下调TLR4、MyD88、IR-1和TRAF6表，这可能是其对TLR4信号通路负调制约之一；且LRP16可能通过下调TLR4信号通路，抑制NF-κB通路活，减少通路下游炎症因子TNF-α、IL-6释放。(3).LRP16能上调MAPK信号通路活。(4).LRP16可能通过PI3-K/Akt信号通路抑制前脂细增殖。关键词：LRP16论文TLR4论文MAPK论文PI3-K/Akt论文增殖论文
缩略词表6-9
中文摘要9-12
Abstract12-16
引言16-25
59材料与策略59-60
结果60-64
讨论64-65
结论65