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摘要：效应记忆T细胞(TEM)上的Kv1.3电压门控钾离子通道是一个治疗神经免疫性疾病多发性硬化症(MS)的新靶点。在前期探讨中,我们获得了一种新型的靶向作用于Kvl.3通道的多肽类阻断剂,命名为ADWX-1,该药物能高效性高选择性地阻断T细胞上的Kv1.3离子通道。我们将其运用于多发性硬化的动物模型—实验性自身免疫性脑脊髓炎(EAE),检测其对EAE模型大鼠的治疗作用并探讨其作用机制。靶向Kv1.3多肽主要通过抑制CD4+CCR7表型的TEM细胞激活来有效治疗EAE模型大鼠。在体内实验中,多肽能降低模型鼠的行为学评分,通过H.E.染色,LFB染色,透射电镜等组织学检测,多肽能减少中枢神经的炎性浸润与脱髓鞘病变,轴索损伤。多肽的神经保护作用可能与其对CD4+T细胞的免疫调节功能有关,ELISA检测结果表明,多肽能降低模型鼠血清的IL-2, IFN-γ TNF-α等Thl类炎性细胞因字的分泌,多肽亦能降低模型鼠中枢神经组织的IL-2分泌。在体外实验中,通过ELISA检测细胞激活后的IL-2分泌水平,多肽抑制了人Jurkat T细胞和模型鼠PBMC细胞的激活,并进一步抑制了模型鼠PBMC细胞的增殖。通过体外流式分选结合ELISA检测活化后细胞因子分泌的策略,多肽能选择性抑制EAE模型鼠中具有CD4+CCR7表型的TEM细胞的活化增殖,而对CD4+CCR7+细胞作用并不显著,维持了这一类细胞在病理状态下的正常免疫功能,有效避开了过度免疫所产生的副作用。为了阐明多肽调节CD4+CCR7细胞激活的作用机制,首先采取流式分选了这一亚型细胞并给予多肽药物干预,通过荧光分光光度法检测Ca2+信号；然后给予Ca2+信号通路及PKCθ信号通路相关的阻断剂,检测IL-2激活诱导的细胞增殖；进一步采取Western-blotting检测NF-κB的激活信号,探讨发现多肽参与了TCR信号转导历程中IL-2通路的激活,多肽除了通过传统的Ca2+信号途径即Kv1.3-Ca2+-NFAT途径转变IL-2信号外,还能通过调节Kv1.3-PKCθ-NF-κB轴线来影响IL-2激活信号。通过RT-PCR及流式细胞术,发现在CD4+CCR7细胞激活历程中伴随了Kv1.3mRNA和蛋白表达的上调,而给予多肽可以减少Kv1.3基因的高表达,多肽对通道表达的调控作用在CD4+CCR7+细胞中并不显著,进一步支持了多肽的选择性作用。由于CD4+CCR7细胞依赖Kv1.3通道活性调节其激活信号,多肽对CD4+CCR7细胞中Kv1.3基因表达的选择性调控影响了细胞的再激活,多肽能够抑制再激活历程中的钙信号与IL-2分泌。多肽对Kv1.3表达及功能的抑制使其对这一表型的细胞激活具有一个长期的抑制效果,有效制约了炎性细胞的大量产生。另外,通过流式检测IL-17+细胞数量和ELISA检测IL-17类细胞因子发现多肽调节了分化后的Th17细胞再激活,但是并不影响细胞因子诱导的Thl7分化历程,这是基于分化后的Thl7细胞具有CCR7-的表型。多肽对CD8+T细胞具有类似作用,多肽可以选择性抑制CD8+CCR7细胞激活后的炎性细胞因子颗粒酶B (GrB)分泌,但是对CD8+CCR7+细胞激活后的GrB分泌并无显著作用,在体内多肽阻止了模型鼠由于CD8+T细胞激活所引起的GrB分泌,进而缓解了细胞毒性的GrB对神经少突胶质细胞损伤,减少了髓鞘蛋白的过量消耗,具有间接的神经保护作用。靶向Kv1.3多肽在EAE模型中具有多种调节功能,主要为选择性抑制Kv1.3高表达的CD4+Effector TEM细胞激活机制,这一效应通过细胞激活历程中多肽作用的两种不同方式来实现：一方面多肽调节了Kv1.3通道的活性及IL-2信号通路,另一方面多肽调控了Kv1.3通道的基因,这些证据提示ADWX-1作为靶向针对T淋巴细胞Kv1.3通道的多肽类阻断剂是一类具有临床运用价值的新型免疫调节剂,对MS等神经免疫性疾病的治疗具有重要作用。关键词：Kv1.3论文EAE论文T_(EM)细胞论文ADWX-1论文
论新点5-7
摘要7-9
Abstract9-11
前言11-26
第一章 IE向Kvl.3多肽对EAE模型大鼠的治疗作用探讨26-44
引言26-27
材料策略27-33
结果33-42
讨论42-44
第二章 IE向Kvl.3多肽对CD4+细胞的作用及分子机理探讨44-98
引言44-46
材料策略46-60
结果60-89
讨论89-98
第三章 IE向Kvl.3多肽对CD8+细胞激活的调节及神经保护作用探讨98-109
引言98-99
材料策略99-101
结果101-107
讨论107-109