试谈引物交叉引物扩增技术快速检测肠出血性大肠杆菌基本-turnitin论文查重

摘要：肠出血性大肠杆菌（EHEC）是一种重要的食源性致病菌。由EHEC所引起的感染已日益成为全球性的公共卫生不足，严重危害人类安全与健康。目前，常用于EHEC的检测策略有：分离培养法、免疫学检测策略、以PCR为主的分子生物学检测策略。这些策略由于有着耗时、灵敏度和特异度低、依赖实验仪器和专业技术人员等缺陷，因而无法用于现场检测以及资源匮乏的地区。由此，有必要建立一种简单、快速且适用于现场检测的策略。恒温扩增技术是一类不需要特殊仪器设备、扩增效率高的核酸扩增技术，在现场检测中具有重要运用价值。交叉引物扩增（cpa）技术是杭州优思达生物技术公司发明的一种等温扩增技术。在恒温条件下，通过5~8条引物的作用，能够扩增目的DNA或RNA。整个反应历程操作简单、扩增效率高，同时具有较高的灵敏度和特异度。该技术作为一种病原体快速检测工具，特别适合用于现场检测。目的：建立肠出血性大肠杆菌的CPA检测策略，为EHEC的检测提供一种灵敏、特异、简单、快速、廉价、有效的手段。策略：针对EHEC的共同毒力基因stx1（GenbankAB030485.1）设计CPA引物；对反应系统中的Mg~(2+)浓度、dNTPs浓度、甜菜碱浓度、Bst DNA聚合酶添加量及引物浓度等反应条件进行优化，确定CPA反应的最佳系统，并对影响CPA反应的因素进行浅析；CPA反应产物通过电泳法、SYBR Green I荧光染料法和一次性核酸检测装置进行检测，并对三种检测策略进行评价；选取10株常见传染性致病菌菌株对本探讨建立的CPA系统进行特异性评价；以PCR策略作对照，以重组质粒和纯培养物两个方面对CPA法检测肠出血性大肠杆菌的灵敏度进行评价。结果：①本探讨最终建立的CPA法快速检测肠出血性大肠杆菌的反应系统如下：引物CPR0.5μM，F3、B3、F2各0.1μM，5F、5B各0.3μM，3mM MgSO4，0.4mM dNTPs，8U Bst DNA聚合酶，2μl10×Thermopol buffer，1M甜菜碱，1μl DNA模板，无菌水补足体积至20μl。反应条件为63℃保温1小时。②CPA反应产物通过电泳法、SYBR Green I荧光染料法和一次性核酸检测装置进行检测后结果一致。采取一次性核酸检测装置检测CPA反应产物，操作简单，与其它两种策略相比，该策略准确、快速、灵敏、特异、有效防止了扩增产物所带来的污染不足。③特异性实验结果表明：CPA法的特异性良好，能区分肠出血性大肠杆菌和其他10株常见传染病致病菌。④CPA法检测肠出血性大肠杆菌重组质粒的灵敏度可以达到10个拷贝数，而平行对照的PCR法检测肠出血性大肠杆菌的灵敏度为100个拷贝数。CPA法检测肠出血性大肠杆菌纯培养物的灵敏度为1.3CFU/ml，平行实验的PCR法灵敏度为13CFU/ml。CPA法的灵敏度是普通PCR法灵敏度的10倍。结论：本探讨建立的CPA法检测肠出血性大肠杆菌的策略具有特异性强、灵敏度高，方便快捷、成本低等特点，为肠出血性大肠杆菌的检测提供了新的进展方向，并且由于该检测策略具有操作简单，不需要昂贵的仪器设备、繁琐的电泳历程、快速省时等优点，更适用于基层及现场检测。关键词：肠出血性大肠杆菌论文交叉引物扩增(CPA)论文快速检测论文

中文摘要4-6

Abstract6-13

第1章前言13-27

1.1 肠出血性大肠杆菌介绍13-18

1.1.1 肠出血性大肠杆菌的发现历史13

1.1.2 肠出血性大肠杆菌的基本特点13-14

1.1.3 肠出血性大肠杆菌的血清型14

1.1.4 肠出血性大肠杆菌的毒力因子14-15

1.1.5 肠出血性大肠杆菌的流行病学特点15-17

1.1.6 临床症状17

1.1.7 治疗17-18

1.2 肠出血性大肠杆菌的检测18-21

1.2.1 细菌分离法18

1.2.2 血清学检测策略18-19

1.2.3 免疫学检测策略19-20

1.2.4 分子生物学检测策略20-21

1.3 CPA 技术及运用21-25

1.3.1 CPA 策略的概述21

1.3.2 CPA 策略的特点21-22

1.3.3 cpa 反应原理22-24

1.3.4 CPA 反应系统24-25

1.3.5 CPA 反应产物的检测策略25

1.3.6 CPA 法的运用25

1.4 本探讨的目的和作用25-27

第2章材料与策略27-39

2.1 实验材料27-29

2.1.1 实验菌株27

2.1.2 主要实验仪器27-28

2.1.3 主要试剂28-29

2.2 实验策略29-39

2.2.1 主要试剂与培养基的配制29-30

2.2.2 引物及探针设计30-31

2.2.3 细菌基因组的提取31-32

2.2.4 肠出血性大肠杆菌 stx1 基因片断重组质粒的构建32-34

2.2.5 CPA 及 PCR 反应系统的建立34

2.2.6 CPA 及 PCR 产物的浅析34-35

2.2.7 CPA 反应条件的优化35-36

2.2.8 CPA 扩增反应引物特异度验证36-37

2.2.9 肠出血性大肠杆菌灵敏度检测37-39

第3章实验结果39-56

3.1 肠出血性大肠杆菌 stx1 基因片断阳性质粒的构建39-42

3.1.1 PCR 扩增肠出血性大肠杆菌 stx1 基因片断结果39

3.1.2 肠出血性大肠杆菌重组质粒菌落 PCR 鉴定结果39-40

3.1.3 肠出血性大肠杆菌 stx1 基因片断阳性质粒的测序结果40-42

3.2 CPA 扩增系统的初步建立42

3.3 CPA 扩增系统的优化结果42-49

3.3.1 Mg2＋浓度的确定42-43

3.3.2 dNTPs 浓度的确定43-44

3.3.3 甜菜碱浓度的确定44-45

3.3.4 Bst DNA 聚合酶添加量的确定45-46

3.3.5 引物浓度的确定46-47

3.3.6 反应温度的确定47-48

3.3.7 反应时间的确定48-49

3.3.8 CPA 反应最终系统及条件49

3.4 CPA 扩增产物的浅析49-51

3.4.1 CPA 扩增产物的电泳结果浅析49-50

3.4.2 CPA 扩增产物核酸荧光染料结果浅析50-51

3.4.3 CPA 扩增产物一次性核酸检测装置结果浅析51

3.5 CPA 反应系统的特异性探讨51-52

3.6 肠出血性大肠杆菌灵敏度检测的探讨52-56

3.6.1 肠出血性大肠杆菌重组质粒的灵敏度检测52-54

3.6.2 肠出血性大肠杆菌纯培养物的灵敏度检测54-56

第4章讨论56-62

4.1 靶基因的选择56-57

4.2 CPA 反应条件的优化57-59

4.2.1 Mg2＋浓度对 CPA 反应的影响57

4.2.2 dNTPs 浓度对 CPA 反应的影响57

4.2.3 甜菜碱浓度对 CPA 反应的影响57-58

4.2.4 Bst DNA 聚合酶添加量对 CPA 反应的影响58

4.2.5 引物浓度对 CPA 反应的影响58

4.2.6 反应温度对 CPA 反应的影响58-59

4.3 CPA 扩增产物的三种浅析策略比较59

4.4 CPA 法检测肠出血性大肠杆菌的策略学评价59-60

4.5 防止 CPA 污染措施60

4.6 CPA 策略运用展望60-62

第5章结论62-63

试谈引物交叉引物扩增技术快速检测肠出血性大肠杆菌基本

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