人脐带间充质干细胞移植对大鼠闭合性颅脑损伤作用

摘要：目的：建立大鼠颅脑损伤(traumatic brain injury, TBI)模型,观察人脐带间充质干细胞(human umbipcal cord mesenchymal stem cells, hUC-MSCs)在损伤脑组织中存活、迁移和分化情况,以及对损伤神经功能恢复的影响；初步探讨hUC-MSCs治疗颅脑损伤的作用机制，为其在颅脑损伤治疗的运用提供论述依据。策略：取足月妊娠剖宫产健康新生儿的脐带，D-Hank’s液充分洗去残留血液,剔除脐动脉和脐静脉，将剩余的脐带间质组织剪成约1mm3大小的组织块，用0.2%胶原酶Ⅱ消化后放入含有20%胎牛血清（fetal bovineserum, FBS）、100U/ml青霉素，100μg/ml链霉素的DMEM/F12中培养。观察原代培养细胞的形态学变化，当细胞达到80％~90％汇合时，进行消化并传代培养。收集消化后的细胞，流式细胞术检测CD45-PE、CD90-PE、CD105-PE、CD73(SH3)-PE、CD11b-PE和CD34-FITC、CD19-FITC，HLA-DR (HLA-II)-FITC，并以小鼠IgG1-PE和小鼠IgG1-FITC作为同型对照。选健康成年雄性Sprague-Dawley (SD)大鼠，体重270g~320g，采取液压冲击法制备颅脑损伤模型，24h后，依照改良神经功能评分(modifiedNeurological Severity Score, mNSS)标准进行神经功能评分（Table1），将7~12分（中度损伤）的50只大鼠纳入试验并随机分为三组：(1) hUC-MSCs组：20只，评分结束后将1,1'-双十八烷-3,3,3',3'-四吲哚羰花青-高氯酸盐(1,1'-dioctadecyl-3,3,3',3'-tetramethypndocarbocyanine perchlorate, DiI)标记的第5代hUC-MSCs移植到颅脑损伤部位，取两点，每点5μl，总细胞数为1×10~6个；(2)磷酸盐缓冲液(phosphate buffered sapne, PBS)组：20只，颅脑损伤部位以PBS替代hCU-MSCs注射，亦取两点，每点5μl；(3)单纯颅脑损伤组：10只，仅行颅脑损伤，损伤部位既不移植hUC-MSCs，亦不注射PBS。另随机选10只大鼠为（4）检测手术组：只开骨窗，不行颅脑损伤，亦不注射hUC-MSCs或PBS。大鼠于hUC-MSCs移植/PBS注射后第1、7、14、21、28d采取mNSS进行神经功能评分，观察大鼠神经功能改善和恢复情况。评分结束后处死大鼠，取脑组织行连续冰冻切片，厚5μm。免疫荧光策略检测hUC-MSCs在脑组织内存活、迁移、分化情况，以及胶质纤维酸性蛋白(gpal fibrillaryacidic protein, GFAP)、神经元特异性烯醇化酶(neuron specific enolase,NSE)、微管相关蛋白2(microtubule-associated protein2, MAP-2)、八因子相关抗原(factor VIII related antigen，Ⅷ-RAg)、神经微丝（neurofilament，NF）、巢蛋白（Nestin）的表达情况。结果：原代细胞培养24h后观察到有少量细胞贴壁，8~10d后细胞大部分贴壁。2w时，细胞汇合达到80％～90％，消化后按1:2或1:3的比例传代。细胞传代后生长迅速，形态均一，5~6d可传一代。流式细胞术检测结果显示：hUC-MSCs表达间充质干细胞表面抗原CD73、CD90、CD105，不表达造血前体细胞表面抗原CD34、B型淋巴细胞表面抗原CD19、中性粒细胞表面抗原CD11b、白细胞表面抗原CD45和HLA-DR，以而证实该细胞是MSCs。移植前采取噻唑蓝[3-(4,5)-dimethylthiahiazol-2-y1-2,5-diphenytetrazopum bromide, MTT]法检测hUC-MSCs细胞活力，细胞存活率达95%以上。移植hUC-MSCs移植后28d内，hUC-MSCs组死亡1只，死亡率4.8%；PBS组死亡10只，死亡率33.3%；单纯颅脑损伤组死亡6只，死亡率37.5%。hUC-MSCs组的死亡率低于PBS组和单纯颅脑损伤组，差别有统计学作用（P0.05）。PBS组（5只）和单纯颅脑损伤组（3只）出现显著腹胀，hUC-MSCs组未发现显著腹胀的大鼠。hUC-MSCs组和PBS组比较，差别无统计学作用（P0.05）；hUC-MSCs组和单纯颅脑损伤组比较，差别有统计学作用（P0.05）。神经功能评分结果（Table3）显示：hUC-MSCs移植后，神经功能评分有随时间变化走势，hUC-MSCs组神经功能恢复优于PBS组和单纯颅脑损伤组，差别有统计学作用（P0.05）。hUC-MSCs移植28d后，脑组织切片行免疫组织荧光检测，发现hUC-MSCs在损伤灶存活，沿白质方向迁移且部分迁移至血管周围。部分移植细胞表达神经干细胞标志Nestin、神经元细胞标志NSE、NF、MAP2、星形胶质细胞表面标志GFAP和血管内皮细胞标志Ⅷ-R Ag。脑组织切片经4',6-二脒基-2-吲哚(4',6-diamidino-2-phenypndole, DAPI)染核发现，脑组织损伤部位细胞核碎裂、溶解，以PBS组和单纯颅脑损伤组数量为多，而hUC-MSCs移植组数量较少。结论:1. hUC-MSCs移植可显著推动大鼠颅脑损伤后神经功能恢复。2. hUC-MSCs可在大鼠颅脑损伤部位存活、迁移，并表达GFAP、NSE、MAP2、NF、Nestin、Ⅷ-R Ag。3. hUC-MSCs移植对颅脑损伤后消化系统功能的恢复可能发挥一定作用。关键词：人脐带间充质干细胞论文颅脑损伤论文细胞移植论文细胞分化论文消化功能论文
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摘要4-7

ABSTRACT7-10

前言10-11

材料与策略11-19

结果19-23

附图23-33

附表33-35

讨论35-38

结论38-39