摘要：急性T细胞淋巴细胞白血病(T-cell acute lymphoblastic leukemia,T-ALL)是来早期T淋巴细胞的高侵袭性恶性肿瘤。,治疗仍以化疗作为首选和基础疗法,但超过50%患者出现复发,平均生存时间少于1年,即使行异基因造血干细胞移植,无事件生存(Event-free survival,EFS)亦仅为30%～50%。因此,深入研究T-ALL的发病机制,寻找新的治疗手段,对提高T-ALL患者的长期存活率。Notch/RBP-J信号途径是进化中保守的信号途径,介导相邻细胞间的作用而在多种胚胎前体细胞以及干细胞的分化中发挥作用,其异常活化与多种肿瘤的发生密切。Notch信号途径与恶性肿瘤的关系最先是在人类T-ALL中被发现。研究,9号染色体上Notch1基因和7号染色体上TCR基因的易位,以及Notch基因的点突变造成的Notch信号异常活化是T-ALL形成及维持的主要机制。尽管已有应用γ-分泌酶抑制剂(γ-secretase inhibitors,GSIs)抑制Notch信号的活化而T-ALL的临床治疗,但文献报道其治疗效果并不理想。究其原因一是γ-secretase不是Notch信号特有的,另一是GSI只能阻断Notch受体的配体依赖性激活,并不能阻断因染色体易位或Notch基因点突变造成的Notch受体胞内区(Notch intracellular domain,NIC)的非配体依赖性持续活化。证据,50%以上T-ALL患者的Notch1异常活化为非配体依赖性活化,因此,寻找广谱的Notch信号抑制剂,对于T-ALL的治疗十分。转录因子RBP-J是DNA蛋白,可介导哺乳类四种Notch受体的转录激活作用。Aster等研究发现Notch1突变体主要与Notch信号关键转录因子RBP-J而调控下游与T-ALL发生基因的表达,应用Notch信号共激活物Mastermind-pke1蛋白显性负突变体(DN-MAML1)可以在核内抑制Notch信号。之后,Brandner等基于对DN-MAML结构的分析,合成了一个稳定的-螺旋小肽SAHM1(Stapled -hepcal peptides derived from MAML1),并证实其可阻止Notch转录激活复合物在核内的组装而抑制Notch信号的持续激活。DN-MAML和SAHM1破坏细胞核内表达的Notch1活性结构而抑制肿瘤细胞生长和促进凋亡,因而相比GSIs,其更能地抑制Notch信号的异常活化。,MAML是具有多种功能的转录激活因子,并不完全特异性作用于Notch信号途径,因此DN-MAML和SAHM1还成功应用于人的肿瘤治疗。KyoT2是一种与RBP-J作用的LIM结构域蛋白,可与NIC竞争RBP-J而抑制RBP-J介导的转录,研究组前期对KyoT2抑制RBP-J介导的转录调控机制的深入研究,发现PcG (polycomb group)蛋白复合物的组分HPC2和RING1可KyoT2与RBP-J作用并抑制RBP-J介导的转录激活,同时证实KyoT2主要PIAS1-催化小泛素修饰反应(Sumoylation)抑制Notch/RBP-J信号途径转录激活。已知小鼠KyoT2在人类的同源物为FHL1C,属于FHL1家族。近期,对临床肿瘤标本比较microarray谱和免疫组化分析,发现FHL1在多种肿瘤组织中都表达下调,如肺癌,乳腺癌,结肠癌和脑肿瘤等,而也发现FHL1C在T-ALL患者中呈低表达。,研究组发现KyoT2基因剔除小鼠不影响动物生存和主要的生理功能。这些研究提示:在T-ALL中过表达FHL1C可能抑制Notch信号途径而阻止T-ALL的发生。基于这样的想法,了如下实验。主要研究结果:1、成功构建了表达FHL1C的真核表达载体pCMV-myc-FHL1C和pEGFP-C1-FHL1C以及慢病毒表达载体pLenti/V5-FHL1C-IRES-GFP。细胞转染、Western-blot、流式细胞仪检测GFP的表达,证实表达载体构建正确。2、Amaxa核酸转染仪,在急性T淋巴细胞白血病细胞系Jurkat细胞中高效表达了FHL1C。细胞绝对数记数、流式细胞仪检测GFP表达、AnnexinV/PI染色、Hoechst核染色以及透射电镜观察Jurkat细胞形态变化等实验,发现在Jurkat细胞中过表达FHL1C可诱导细胞凋亡。3、初步探讨了过表达FHL1C促使Jurkat细胞凋亡的分子机制。报告基因实验证实FHL1C同样可抑制RBP-J介导的Notch信号途径的转录; Western-blot和RT-PCR证实其可抑制下游与T-ALL发生分子Hes1、Hes5和c-Myc的表达,促进凋亡基因,如Fas和Caspase-3等的表达,抑制抗凋亡基因,如Bcl-2和Bcl-xl等的表达。总之,的研究结果,过表达FHL1C促进了T淋巴细胞白血病细胞系Jurkat细胞的凋亡,其可能的机制是抑制了Notch信号途径下游与T-ALL发生分子Hes1、Hes5和c-Myc的表达和促进了凋亡基因的表达。以上这些研究结果提示过表达FHL1C可能对T-ALL具有靶向杀伤作用。该研究将为今后深入研究FHL1C促T-ALL细胞凋亡的分子机制奠定基础,并为以FHL1C为靶标,设计不受细胞微环境影响、并特异靶向RBP-J的新型Notch信号阻断剂理论研究基础。关键词：Notch信号途径论文RBP-Jκ论文FHL1C论文急性T淋巴细胞白血病论文细胞凋亡论文
缩略语表7-9
中文摘要9-12
Abstract12-16
前言16-18
文献回顾18-32
FHL1C 真核表达载体和慢病毒表达载体构建及验证32-43
1 实验32-34
1.1 、质粒、细胞系和细菌品系32
1.2 常用分子生物学试剂32-33
1.3 常用缓冲液试剂33
1.4 主要仪器33-34
2 实验方法34-36
2.1 RNA 提取和RT-PCR34
2.2 分子克隆34-35
2.3 细胞培养35
2.4 真核表达载体构建及转染35
2.5 病毒表达载体构建及转染35-36
2.6 流式细胞检测36
2.7 Western blot36
3 实验结果36-42
3.1 FHL1C 基因克隆，载体成功构建36-39
3.2 真核表达载体pCMV-myc-FHL1C 的构建及验证39-40
3.3 慢病毒表达载体pLenti6/V5-FHL1C-IRES-GFP 构建及验证40-42
4 讨论42-43
过表达FHL1C 对于JURKAT 细胞（急性T 淋巴白血病细胞）的生物学特征的影响43-56
1 实验43-45
1.1 、质粒、细胞系和细菌品系43
1.2 常用分子生物学试剂43-44
1.3 主要缓冲液和试剂44
1.4 主要仪器44-45
2 实验方法45-48
2.1 真核表达载体构建45
2.2 细胞培养45
2.3 Amaxa 核酸转染45
2.4 Western Blot45-46
2.5 细胞生长曲线绘制46
2.6 细胞周期46-47
2.7 Hoechst 染色47
2.8 透射电镜47-48
2.9 AnnexinV/ PI 凋亡检测48
3 实验结果48-54
3.1 pEGFP-C1-FHL1C 真核表达载体构建48-49
3.2 过表达FHL1C 的Jurkat 细胞绝对数减少49-50
3.3 过表达FHL1C 的Jurkat 细胞增殖无异常50-51
3.4 过表达FHL1C 的Jurkat 细胞凋亡增多51-54
4. 讨论54-56
FHL1C抑制NOTCH信号诱导T-ALL细胞凋亡的分子机制初步探讨56-66
1 实验56-58
1.1 、质粒、细胞系、细菌品系56
1.2 常用分子生物学试剂56-57
1.3 常用缓冲液试剂57
1.4 主要仪器57
1.5 实时定量PCR 引物序列57-58
2 实验方法58-60
2.1 细胞培养及转染58
2.2 双荧光素酶报告基因58-59
2.3 Amaxa 核酸转染59
2.4 流式细胞分选59
2.5 RNA 提取和 RT-PCR59
2.6 Real-time PCR59-60
2.7 Western blot60
3 实验结果60-64
3.1 过表达FHL1C 抑制RBP-J 介导Notch 信号途径的转录60-61
3.2 过表达FHL1C 的Jurkat 细胞中 Notch 下游基因表达下调61-62
3.3 过表达FHL1C 的Jurkat 细胞中凋亡分子表达上调，抗凋亡分子表达下调62-64
4 讨论64-66
小结66-67
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