摘要：生态环境的,各种生物和非生物因素制约玉米生产的障碍。其中,干旱是限制玉米生产最主要的限制因子。品种选育改良玉米的耐旱性是减轻干旱危害最为经济的措施,但对耐旱性的遗传机制有一个较为深入的了解。玉米的耐旱性是由多基因控制的复杂性状,尽管已用多种分子生物学手段克隆了与之的功能基因,并对其在干旱胁迫条件下的表达特性等了多的研究,但仍然不能很好地解析玉米耐旱性的分子机理,为耐旱性遗传改良的分子育种技术支持。近年来的研究,一类非编码小分子RNA——microRNA (miRNA),参与基因表达调节。研究其在干旱胁迫条件下的差异表达,可望从另一个揭示植物耐旱性的分子机理。有研究,植物中保守性很强的miR159和miR168与逆境胁迫调控有关。本实验已有的研究报道,以前期鉴定的玉米干旱敏感型自交系丹340、21ES和耐旱型自交系87-1、81565为,利用miRNA芯片杂交技术,检测miR159和miR168在聚乙二醇(PEG6000)模拟干旱胁迫条件下的差异表达。经锁核苷酸Northern (Locked-nucleic acid Norhtern, LNA-Northern)杂交验证后,用WMD3软件对miR159和miR168的靶基因生物信息学预测,并用数字基因表达谱(Digital Gene Expression Profipng, DGE)分析技术分析相同模拟干旱胁迫条件下这些靶基因在不同自交系间的表达差异,探索miR159和miR168在干旱胁迫条件下对其靶基因可能的调控模式。主要结果如下：1.在干旱胁迫条件下miR159家族的成员大多上调表达,但在耐旱性不同的自交系间及不同干旱胁迫时间段的表达差异情况不尽相同。推测,miR159家族成员间的碱基序列大体,但对干旱胁迫的响应以及对靶基因的调控可能发挥不同的作用。2. miR168家族两个成员的表达在丹340、21ES和87-1自交系中均不同被抑制降低。但在强耐旱性自交系81565中,仅miR168b成员的表达发生了变化。暗示miR168a和miR168b这两个成员在干旱胁迫下可能扮演着不同的角色。3. LNA-Northern杂交验证miR168在相同干旱处理方式下的表达,发现Northern杂交结果和芯片杂交结果完全一致,证实了芯片杂交结果的可信性。4.使用在线靶基因预测软件WMD3,共预测到32个miR159的潜在靶基因,4个miR168的潜在靶基因。其中,一靶基因被多个miRNA家族内的成员共同调控,还有靶基因特异被某些(?)mRNA成员调控。这些靶基因都涉及各种最基本调控通路的上游。5.数字表达谱分析差异表达靶基因时发现：miR159的靶基因MYB55类似蛋白mRNA的表达特异在强耐旱自交系81565中下调。Rac GTP酶激活蛋白1mRNA的表达特异在干旱敏感型自交系中上调。RNA binding S1在每个自交系中都出现了表达量变化,但在81565中的表达趋势与其他三个自交系相反；miR168的靶基因AGO1在除丹340的其他三个自交系中上调表达,在胁迫的后期阶段,下调的miR168强烈的上调AtIDD2类似蛋白mRNA的表达,其表达量的差异与未处理相比较达到了1379.57倍。6.将差异表达的靶基因分析miR159和miR168潜在的调控机制,推测保守的miR159和miR168家族可能是干旱应答途径上游的调控因子。关键词：玉米论文干旱胁迫论文miR159论文miR168论文miRNA微阵列论文LNA-Northern杂交论文数字芯片表达谱论文
摘要4-6
ABSTRACT6-11
1 前言11-27
1.1 microRNA的发现11
1.2 miRNA的生物合成机制11-14
1.2.1 动物miRNA的生物合成机制12-13
1.2.2 植物miRNA的生物合成机制13-14
1.3 miRNA的作用机制14-15
1.4 植物miRNA的功能15-18
1.4.1 植物miRNA在生长发育中的作用15-16
1.4.2 植物miRNA在非生物胁迫中的作用16-18
1.5 检测miRNA表达的方法18-23
1.5.1 miRNA微阵列技术19
1.5.2 Northern blotting法19-20
1.5.3 原位杂交法20-21
1.5.4 纳米孔检测miRNA法21
1.5.5 实时荧光定量PCR21-22
1.5.6 滚环扩增法22-23
1.6 植物miRNA的靶基因预测23-24
1.7 植物抗旱机理研究24-26
1.7.1 干旱对植物形态结构的影响24
1.7.2 干旱胁迫对植物生理生化的影响24-25
1.7.3 干旱胁迫下的基因表达调控网络25-26
1.8 本研究的目的26-27
2 和方法27-35
2.1 的处理27
2.2 总RNA的抽提与质检27-29
2.2.1 总RNA的抽提28
2.2.2 RNA的质检28-29
2.3 miRNA芯片杂交29
2.4 LNA-Northern Blot验证29-33
2.4.1 所需试剂30
2.4.2 LNA-Northern杂交流程30-33
2.5 差异表达miRNA的靶基因预测33
2.6 数字基因表达谱分析差异表达基因33-35
3 结果与分析35-44
3.1 总RNA的质量35
3.2 干旱胁迫下miRl59和miR168的差异表达35-40
3.3 LNA-northern杂交结果40-41
3.4 miRNA的靶基因预测41-42
3.5 数字基因表达谱分析差异表达的靶基因42-44
4 讨论44-49
4.1 miR159的靶基因在干旱胁迫下的潜在作用44-46
4.2 miR168的靶基因在干旱胁迫下的潜在作用46-47
4.3 植物逆境miRNA的研究方法47-49
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