志贺氏菌毒力大质粒对染色体调控

摘要：志贺氏菌属(Shigella spp.)细菌是一类革兰氏染色呈阴性的杆状病原菌,又称为痢疾杆菌,其主要传播途径为粪口途径,食物和水消化道之后借助自身释放的毒力因子而突破胃肠屏障,侵入肠上皮细胞后发生的增殖和扩散,从而引起炎症,机体则表现为发热、脱水、便血、腹痛及腹泻等,临床上称为细菌性痢疾,严重的情况下能导致菌血症,儿童自身免疫力较低而了主要的易感人群。并且细菌性痢疾的感染量极低,一般情况下10-100个病原菌就足以引起典型的感染症状,而这也是导致痢疾是发展中国家最主要的传染病的原因之一,据不完全统计,每年1.65亿痢疾患者中1.63亿分布于发展中国家,而在我国痢疾也有很高的发病率。另外,细菌性感染的主要治疗手段是使用抗生素,方法尽管在开始的时候见效很快,但是病原菌自身突变的发生,耐药菌株不断出现,导致现在超过90%的志贺氏菌临床分离菌株对多种抗生素都具有一定的耐受性。尽管疫苗可以作为治疗痢疾的途径,但是尚未完全揭示志贺氏菌的具体致病机理以及宿主自身的免疫应答机制,因此这也就了疫苗的开发和临床应用的瓶颈。以上志贺氏菌自身的危害性以及治疗手段的有限性,志贺氏菌的基础性研究对于我国的卫生防疫工作就显得尤为迫切和必要。大肠杆菌作为一类非致病性的肠道菌,尽管与志贺氏菌在表现型和致病性非常大的差异,但现代分子生物学研究却发现二者在基因组上的同源性和性,它们的区别主要在于毒力大质粒(virulent plaid),所以有志贺氏菌是由大肠杆菌毒力大质粒进化而来的。侵袭性质粒的是志贺氏菌毒力性状的关键性因素。毒力大质粒是志贺氏菌胞内游离于基因组之外的一个220kb左右的环状结构,携带了侵袭和致病所需的大基因。已有研究证明,仅仅是毒力大质粒并不能使大肠杆菌K-12与志贺氏菌相同的致病性,这就了从大肠杆菌到志贺氏菌的进化,还包含了志贺氏菌的基因组与毒力大质粒之间的协同进化,适应,彼此协调。比如致病适应性突变(Pathoadaptive Mutation)即是志贺氏菌调整染色体上某些基因的功能,使毒力大质粒之后的突变株改变有关的表型从而更好地适应选择压力,使的毒力大质粒上的毒力基因充分的表达。在的研究中,鲜有关于志贺氏菌毒力大质粒对染色体调控的报道,而这也正是本研究的出发点和切入点。近几年来,基因组学的迅速发展,已先后完成了福氏志贺氏菌2a 301和2a 2457T等具有代表性菌株的测序工作,而这也为蛋白质组学研究的开展奠定了基础。本研究借助比较蛋白质组学方法从蛋白角度对志贺氏菌的基因组和毒力大质粒之间的调控了一系列基础性研究,这将为揭示志贺氏菌的进化及致病机理一个新的思路和视角。,本研究质粒不相容原理利用pKD46inc温敏型载体驱除了志贺氏菌毒力大质粒,构建了毒力大质粒无痕缺失突变株301△pCP,M90T△pWR501。利用质粒诱动转移技术,固相交配,在辅助质粒pRK2013的协助下,将因整合了pXL275质粒而带有氯霉素抗性标记的志贺氏菌福氏2a 2457T株、福氏2a 301株以及福氏5a M90T株的重组毒力大质粒导入非致病大肠杆菌MG1655中,构建了三株大肠杆菌毒力大质粒导入突变株MG1655/pXL275-virG:p、MG1655/pXL275-virG:pCP以及MG1655/pXL275-virG:pWR501。为了消除pXL275质粒的导入对实验造成的影响,利用同源重组将pXL275质粒整合到MG1655基因组中构建了阴性对照突变株MG1655/pXL275。在此基础上对MG1655野生株、阴性对照突变株以及三株毒力大质粒导入突变株了生理生化特征的研究,结果:毒力大质粒以及pXL275质粒的导入对大肠杆菌MG1655的物质代谢影响不大。另外,本研究借助比较蛋白质组学方法这一手段对所构建的阴性对照突变株、毒力大质粒导入突变株、MG1655野生株,毒力大质粒无痕缺失突变株及其对应的志贺氏菌野生株的蛋白表达了比较分析。制取了以上菌株37℃培养至生长晚期的全菌蛋白样品后,应用双向凝胶电泳建立了相对应的双向电泳图谱,比对图谱,找出了差异表达蛋白并了胶内酶切和质谱鉴定,结果:比较阴性对照突变株和MG1655野生株的双向电泳谱,发现pXL275质粒对MG1655的蛋白表达产生的影响;比较毒力大质粒无痕缺失突变株和对应的志贺氏菌野生株的蛋白表达谱,发现毒力大质粒的驱除导致了IpaA、IpgC、VirA以及Mxi-Spa类蛋白等毒力蛋白的缺失;比较毒力大质粒导入突变株和MG1655野生株的蛋白表达谱,发现毒力大质粒的导入除了引起有关毒力蛋白的表达之外,也抑制了MG1655酸抗性的谷氨酸脱羧酶的表达,而酸抗性则是与肠道菌的生存密切的。双向电泳中蛋白样品已经发生了变性裂解,所以双向电泳图谱中展示的是蛋白单体的信息,而细胞内大多数蛋白功能的发挥是与其它蛋白形成复合物来实现的,所以为了蛋白质作用的信息,本研究又对以上菌株了BN/SDS-PAGE电泳,结果:pXL275质粒对MG1655的复合物表达的影响;而毒力大质粒的导入则改变了MG1655中复合物种类,即对大肠杆菌中的蛋白调控网络产生了一定的影响。综上所述,本研究成功构建了毒力大质粒的缺失突变株,导入突变株以及阴性对照突变株,并在此基础上了菌株之间蛋白单体及复合物的差异表达信息,这都为下一步深入揭示志贺氏菌的染色体和毒力大质粒之间的调控了的线索和视角。另外,本研究在构建毒力大质粒导入突变株中所的质粒诱动转移设计也为有关重组菌株的构建了新的思路。关键词：福氏志贺氏菌论文比较蛋白质组学论文毒力大质粒论文BN/SDS-PAGE论文

缩略语索引4-5

摘要5-8

ABSTRACT8-11

前言11-25

1.1 志贺氏菌介绍11-12

1.2 志贺氏菌的致病机理12-16

1.3 机体对志贺氏菌的免疫应答16

1.4志贺氏菌毒力大质粒上的毒力基因的调控16-17

1.5 志贺氏菌与大肠杆菌之间的进化关系17-18

1.6 本研究的目的和18-19

1.7 参考文献19-25

MG1655 导入志贺氏菌毒力大质粒突变株、志贺氏菌毒力大质粒缺失突变株的构建25-39

1 与方法26-31

2 结果31-35

3 讨论35-36

4 小结36-37

5 参考文献37-39

MG1655 野生株、志贺氏菌野生株及相应突变株的蛋白表达谱39-63

1 与方法40-46

2 结果46-56

3 讨论56-60

4 小结60

5 参考文献60-63

MG1655 野生株及突变株的复合物分析63-73

1 与方法64-67

2 结果67-70

3 讨论70-71

4 小结71

5 参考文献71-73

文献综述：细菌质粒的驱除73-80