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摘要：外阴检测丝酵母菌病(vulvovaginal candidiasis, VVC)是由念珠菌(Candida spp.)引起的一种常见的外阴炎,75%的生育年龄女性一生中至少会患一次VVC,让人担忧的是VVC患者中40%-50%会反复发作。根据疾病的发作频率和临床体现的严重程度,医学工作者们将VVC划分为单纯性VVC(轻度和中度)和复杂性VVC(包括一年中发作4次及以上的复发性VVC (recurrent vulvovaginal candidiasis, RVVC)、重度VVC、非白色念珠菌感染的VVC、糖尿病及妊娠合并的VVC以及其他免疫疾病的VVC患者)。全球约5%-8%的妇女遭受RVVC的困扰,这种反复发作又经久不愈的疾病特点,严重干扰了妇女的身心健康。RVVC的发病与多种因素有关,其发病机制至今尚未完全明确；但究其病因可归因于宿主与致病菌两方而因素。目前,对于这两方面的探讨均能见到不少的报告且探讨方向各不相同。近几十年的动物及临床探讨结果均有显示：适应性免疫可能不是主要的保护免疫机制,天然性免疫被认为是粘膜念珠菌感染的主要防御机制。对于致病菌而言,致病菌的来源及致病菌本身的致病能力成为大家探讨的重点及热点。对于引起RVVC反复发作的致病菌源,各国学者仍有争议,不同的探讨显示出不同的探讨结果,可能是因为生殖系统的特殊性及念珠菌在人体各器官的广泛定植造成了外阴检测丝酵母菌感染源的复杂性。目前对于RVVC复发的感染源主要有着三方面的检测说：1.内源性感染：念珠菌作为微环境的正常菌群之一,无症状正常人群带菌率为5-10%。对分离自健康人群同一个体的不同解剖部位和不同个体同一解剖部位的白色念珠菌进行基因型浅析,探讨结果发现同一个体不同解剖部位的菌株基因型显著不同,而不同个体同一解剖部位的菌株基因型相同或相似。国外学者对复发性VVC患者在连续两次发作期间以不同解剖部位分离出的白念珠菌进行了生物学分型和基因分型显示大多数VVC的复发是内源性的。在美国爱荷华地区甚至发现了一株专性定植的菌株。我国学者白凤彦教授以分子遗传学方面解释了白色念珠菌基因型与菌株的定植部位有关,定植部位的微环境对定植其中的菌株有选择性,来源菌株具有特异性。国外探讨发现VVC患者经抗真菌治疗后紧接着行分泌物真菌检测20-25%的女性念珠菌感染阴性,但在治疗后30天再次行检测时绝大部分患者再次体现为阳性；并且治疗前后两次急性发作的致病念珠菌菌种超过2/3是一致的。这些残留的低浓度菌株很有可能导致下一次的继续复发。正常无症状带菌人群与炎患者来源的白色念珠菌基因型浅析发现,两组菌群基因型分布具有相似性,提示VVC的发生主要是内源性的感染。有学者提出子宫内膜可能是念珠菌的一个存储池随着月经周期子宫内膜的脱落而引起感染,但目前没有任何实验数据支持该论点。2.消化系统来源：念珠菌作为条件性致病菌寄生于口腔、胃肠道及等部位的粘膜皱褶,探讨者提出肛门可以成为念珠菌定植的最初来源,并且通过对直肠分离的念珠菌和分离的念珠菌进行比较发现两处来源菌株具有一致性的特点,提出肠道是念珠菌炎感染致病菌的持久存储器。而近期国内外对念珠菌基因型浅析发现同一患者及其他部位分离出的白念珠菌基因型分布具有显著差别。3.性传播：白色念珠菌也是男性念珠菌感染的主要病原菌。关于或其他性活动是否可引起念珠菌的交叉感染的不足一直没有定论,我国一直以来都未将念珠菌病归在性病的范畴。对RVVC的探讨发现男性至少有一个部位分离株的Ca3类型与其对应女性外阴分离株的类型高度相似或完全相同,且RVVC患者及其无症状性伴侣不同解剖部位的念珠菌浅析发现大部分无症状性伴侣身上都能够找到与RVVC患者致病菌株基因型相同的菌株。有探讨表明VVC患者无症状性伴侣携带念珠菌是非VVC患者性伴侣的4倍。RVVC患者性伴侣中20%的人有着念珠菌感染,且感染的菌株相同,男性念珠菌性龟头炎来源的致病菌株的基因型的分布与女性念珠菌性炎致病菌株的分布特点非常相似,都具有相同的优势基因型。以另一个方面提示,男性致病白色念珠菌与女性炎致病念珠菌有着性传播的可能。但Shihadeh等则认为对于性伴侣的治疗不会影响RVVC治愈率和复发率。随着念珠菌分子遗传学探讨的进展,以基因水平探讨白色念珠菌致病性与疾病类型的联系成为走势。不同国家和地区的探讨者们针对白色念珠菌的基因型进行了大量的工作。以菌株指纹浅析开始,限制性片段长度多态性浅析和微卫星序列浅析的采取,使白色念珠菌基因分型的策略不断取得突破。其中微卫星序列多态性浅析策略是一种基于PCR扩增的DNA指纹图谱浅析策略。微卫星即末端短片段重复序列(short tandem repeats, STR)或短片段重复序列(shortsequence repeats, SSR),是指以少数几个核苷酸(多数为2-4个)为单位多次串联重复的DNA序列。微卫星寡核苷酸的重复次数在同一物种的不同菌株间有着很大差别,由此微卫星标记可用于菌株分子分型的探讨。Sampaio等(2003,2005)报道的四号染色体的非编码区的微卫星序列CAI有高度多态性,通过对其进行基因扫描,可以达到0.97的分辨率,是迄今为止单位点浅析所能达到的最大的分辨率。而单链构象多态性(Single Strand Conformation Polymorphi, SSCP)技术其论述基础是单链DNA具有序列特异性的二级或构象,1个或多个碱基的变异能影响其构象,在非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳中,构象的转变体现为单链DNA迁移率的转变。由此,把双链DN段在加热或变性剂的作用下生成单链,在非变性聚丙烯酰胺凝胶上电泳,根据各样品的单链迁移率,就可以把突变体和非突变体区分开,以而达到分离菌株的目的,具有高灵敏性,将SSCP引入CAI区的基因型浅析,并结合GeneScan技术,对大样本临床来源致病白色念珠菌的基因型浅析具有经济、方便而精确的优势。综上,RVVC感染源是内源性的复发或还是外源性的感染,性传播是否是RVVC患者发病和复发的重要传播途径。国内外探讨有着分歧。本探讨通过浅析RVVC患者多次急性发病的致病念珠菌菌种分布特点,以及RVVC、单纯VVC、正常人群来源念珠菌的基因分布特点,旨在以病原学方面进一步探讨RVVC复发途径及白色念珠菌基因型与RVVC复发的联系。探讨目的探讨通过观察RVVC患者多次急性发作期分泌物念珠菌菌种分布,明确RVVC患者多次发病的主要致病菌,并通过浅析同一病人多次发病白色念珠菌基因型的分布特点,了解RVVC发病理由及临床症状的严重程度与白色念珠菌基因型是否有着联系,以病原学方面进一步探讨RVVC复发途径及白色念珠菌基因型与RVVC复发的联系。材料和策略1.探讨对象的纳入标准：年龄18-50岁之间的妇女,平均年龄32.5岁。孕妇、糖尿病、免疫缺陷及长期服用抗生素的人群不纳入探讨对象。RVVC的诊断标准：1年中发作VVC=4次,就诊分泌物涂片念珠菌阳性。2009年10月至2010年9月珠江医院妇科门诊就诊,信息符合纳入标准的80名RVVC、66名VVC患者,进行急性期分泌物念珠菌的分离。同时对2010年6-8月我院体检中心体检的无临床症状体征,分泌物镜检阴性的298位健康妇女行分泌物的培养,分离念珠菌。对于RVVC患者进行规范治疗及后期随访,患者再次发病时再次进行致病菌的分离培养,记录RVVC患者每次复发的相应资料。参照2004年中华妇产科学分会感染性疾病协作组关于外阴、念珠菌病诊治规范中评分标准对RVVC每次急性发病期、单纯VVC患者急性发病期临床症状的严重程度进行评分。2.用无菌棉签取患者侧壁分泌物,将分泌物涂10%KOH溶液悬滴镜检,高倍镜镜检可见菌丝或孢子。将新鲜标本直接接种于加有氯霉素的YPD富集液体培养基培养至液体浑浊,将浑浊的菌液涂布于沙保弱固体平板培养基,28。C培养48-72小时后取出观察,见乳酪样菌落生长,挑选单菌落划线培养于YPD培养基,经过3次反复分离纯化后,再挑选单菌落接种于YPD固体斜面培养基进行活化。3.菌种鉴定：通过形态学初步鉴定菌种类别,再利用酶消化法提取念珠菌总DNA,经过ITS1区PCR产物的SSCP图谱浅析,对具有代表性的菌株进行ITS序列或D1/D2序列PCR扩增,将PCR产物送测序公司测序,将测序结果与EMBL/DDBJ/GenBank中的已知念珠菌序列相比对,确定菌株种属。4.白色念珠菌基因型浅析；所有测序后明确为白色念珠菌的菌株行CAI区序列的PCR产物进行SSCP电泳浅析,将具有不同SSCP图谱的菌株用荧光标记的CAIF引物(5’端用6-carboxyfluorescein标记)和CAIR引物重新扩增,PCR产物在ABI370浅析仪上进行电泳,然后用GeneScan3.7浅析软件自动浅析片段的大小,以菌株ATCC90028的CAI两个等位基因位点重复片段数(27-38)为标准,确定待测白色念珠菌菌株的CAI基因型。5.采取SPSS13.0统计软件包进行统计学浅析。组间各菌种的构成比差别比较、VVC患者临床症状与致病菌株种类、基因型种类的比较以及RVVC患者、偶发VVC患者及无症状带菌者中致病菌优势基因型及非优势基因型分布差别的组间比较采取χ2检验；若有论述数小于5则采取校正卡方检验；计量资料组间比较采取两样本t检验；以上检验均以P0.05为有统计学作用。探讨结果1. RVVC患者、偶发VVC患者及无症状正常人群分泌物念珠菌培养阳性率分别为100.0%、100%、9.7%,RVVC患者分泌物培养菌株132株,白色念珠菌89株(67.4%),光滑念珠菌38株(28.0%),滑念珠菌2株(1.5%),季也蒙毕赤念珠菌1株(0.8%),C.nivariensis2株(1.5%),Issatchenkia orientaps1株(0.8%)。其中,RVVC组包含36名重复取样2-4次的标本。偶发VVC患者分泌物培养菌株66株,其中白色念珠菌51株(77.3%),光滑念珠菌14株(21.2%),热带念珠菌1株(1.5%)。正常人群分泌物培养菌株29株,其中白色念珠菌13株(44.8%),光滑念珠菌13株(44.8%),热带念珠菌1株(3.4%),滑念珠菌2株(6.9%)。三组人群中白色念珠菌与非白色念珠菌所占比例差别有统计学作用(χ2=9.653,P=0.008),白色念珠菌仍是RVVC及偶发VVC的主要致病菌,但RVVC患者与偶发VVC患者来源白色念珠菌与非白色念珠菌所占比例差别无统计学作用(χ2=2.060,P=0.151)。2.三组人群来源的153株白色念珠菌,CAI区序列浅析共获得38种CAI基因型,炎来源的140株白色念珠菌最常见的基因型为CAI30-45(45株,占32.1%)、CAI32-46(23株,占16.4%),同时发现与这两种基因型非常接近的并且在CAI片段上只相差1-2个三碱基片段的重复,即基因型为30-32-43-47,共占66.0%,呈显著优势分布；与正常人群来源优势基因型比例23.1%(3/13株)差别有统计学作用(χ2=9.676,P=0.002)。其中RVVC患者来源菌株中优势基因型所占比例为(64/89株)72.0%,偶发VVC患者来源菌株优势基因型所占比列为(34/51株)66.7%,两者差别有无统计学作用(χ2=0.424,P=0.515)。3.对36名确诊为RVVC并且有一定随访条件的患者,进行多次急性期取样,6个RVVC患者进行了3次急性发作期取样,5个RVVC患者进行来了4次的分泌物取样,其余各行2次急性发病期分泌物菌株分离培养,共培养菌株88株,非白色念珠菌21株,白色念珠菌67株；白色念珠菌CAI基因型共20种,其中30-45为23株(34.3%),32-46为11株(16.4%),32-47为7株(10.4%),其他17中基因型多为1-3株。前后2次急性发作感染同种菌种的患者为28位,占77.78%(28/36)。其中两次感染均为白色念珠菌的患者为25位,前后感染同一基因型白色念珠菌菌株的RVVC患者为19位(19/36=52.8%),基因型30-45为8名,32-46为4名,32-47为2名,其他各基因型为1名。4.198名炎患者中(包括RVVC复发时看作新的探讨对象),根据临床症状严重程度评分结果,其中重度VVC95人,轻中度VVC103人。重度VVC患者来源的95株念珠菌,白色念珠菌59株(62.1%),光滑念珠菌31株(32.6%),滑念珠菌1株(1.0%),热带念珠菌1株(1.0%),其它3株(3.1%).轻中度VVC来源的103株念珠菌,白色念珠菌81株(78.6%),光滑念珠菌21株(20.4%),滑念珠菌1株(0.9%)。重度VVC与轻中度VVC患者白色念珠菌及非白色念珠菌的感染率差别有统计学作用(χ2=6.524,P=O.011),非白色念珠菌在重度VVC患者中感染率增高。同时,对RVVC患者及偶发VVC患者临床症状严重程度的比较中发现,两者之间差别无统计学作用(χ2=0.496,P=0.481).5.59位重度VVC和81位轻中度VVC患者感染白色念珠菌,对其基因型分布统计发现,重度VVC患者感染白色念珠菌基因型中,优势基因型30-45和32-46分布为49.2%(30株)和13.6%(8株),而在轻中度VVC患者中,以上两种基因型菌株依次为(15株,18.5%)和(15株,18.5%)。同时,与30-45和32-46相差1-2个碱基的优势基因型菌株在重度VVC和轻中度VVC患者中分别为14株和16株,两组人群优势基因型白色念珠菌分别占88.1%(52/59)和56.8%(46/81),两组差别有统计学作用(χ2=15.971,P=0.000)。结论1.导致我国外阴检测丝酵母菌病的主要致病菌仍为白色念珠菌；但非白色念珠菌的比例有所升高。2.炎患者来源的念珠菌基因型包含了正常无症状携带者来源念珠菌的基因型,与其他探讨者对人体其他部位定植念珠菌基因型不同,更能说明炎的感染是内源性的感染。3.炎患者来源的白色念珠菌基因型集中分布于30-45和32-46,呈现出优势基因型分布特点,说明白色念珠菌基因型与念珠菌炎发病有关。4.同一RVVC多次急性复发有着感染相同菌种的走势,部分患者甚至是感染相同基因型的菌株,而大部分为优势基因型菌株,说明RVVC复发的感染源是来源于内的残留致病菌,而且白色念珠菌基因型与RVVC复发相关。5.外阴检测丝酵母菌病临床严重程度与感染菌种的类型有关,非白色念珠菌种更容易导致重度VVC；白色念珠菌基因型与临床症状严重程度亦相关,优势基因型菌株导致的严重的临床症状,说明基因型与白色念珠菌致病能力有关。关键词：复发性外阴检测丝酵母菌病论文白色念珠菌论文基因型论文复发途径论文单链构型多态性论文基因扫描论文
摘要3-11
ABSTRACT11-23
前言23-30
材料与策略30-41
1、主要仪器与耗材30-32
2、临床标本采集和分类32-34
3、菌株鉴定34-38
4、白色念珠菌基因型浅析38-40
5、统计学策略40-41
结果41-55
1、样本来源41
2、菌种的分类鉴定41-45
3、白色念珠菌基因型浅析45-49
4、RVVC患者多次急性发病期的菌种及白念基因型分布49-52
5、VVC临床症状与致病菌种及基因型的联系52-55
讨论55-63
1、外阴检测丝酵母菌病致病念珠菌分布特点55-57
2、白色念珠菌基因型与RVVC复发57-60
3、白色念珠菌基因型与临床症状60-61
4、本探讨的作用61-62
5、本探讨的不足与进一步的探讨设想62-63
结论63-64