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摘要：探讨背景与目的皮肤色素代谢障碍与多种体内因素和环境因素密切相关,色素障碍性疾病(如白癜风、黄褐斑)易诊而难治。随着分子生物学技术的广泛运用,有关色素代谢的探讨迅猛开展。国内外学者积极探讨色素代谢的机制及影响因素,阐述中药调节色素代谢的作用机制,为治疗色素代谢性疾病寻找安全、有效的中药成分或方剂,对有关中药与色素的代谢方面进行了广泛的探讨,但目前对其作用机理与规律仍未能得到深入的科学阐述,由此临床上缺乏较为理想治疗手段及策略。目前许多中药对酪氨酸酶活性、黑素细胞代谢的影响已经有了初步的揭示,探讨的策略技术亦日益成熟。但是,大多数探讨都局限于观察单味中药或复方中药的探讨上,鲜有以中药色象论述的角度设计较为系统的多层次的探讨,有关色象中药对黑素代谢影响与干预机理的探讨尚为缺乏。吾师杨柳教授通过长期的临床探讨与论述探讨,在取象比类思维启迪下创立了治疗色素性皮肤病的中药色象论述,形成了具有鲜明特点的论述和治疗策略。认为中药颜色与色素性皮肤病的疗效有一定的相关性,并首次将这种表明药材颜色与疗效相关的现象称之为“中药色象”,将这种治疗色素病色效相关的中药,称之为“色象中药”。初步探讨中药药材颜色与色素性皮肤病的疗效之间的联系,并取得了一定的成果。我们的初步探讨结果和以往学者的探讨表明对药材本身的颜色与药效有着一定的联系,由此对中药色象论述的进一步探讨,尤其是运用现代科学探讨策略技术,对色象中药调节与干预色素代谢机理的现代分子学探讨是非常有必要的。另外,白癜风作为色素脱失性疾病的典型病种,临床上易诊而难治。中医药治疗白癜风具有鲜明的特点,强调证候分型与辨证论治。但目前白癜风的证候分型及方药种类繁多,缺乏统一性和标准化。此外,在临床实践中许多白癜风患者出现“无症可辨”或“少症如何辨”的情况,基本除了皮肤出现白斑以外,没有其他特殊的伴随症状。对此,吾师提出了以“祛风、活血、补肾”为基本治则,并结合分期论治的治疗案例。基于此,本探讨通过查阅大量的文献资料及临床资料,并结合临床实践经验,在以往探讨的基础上,筛选出中医传统治验及现代探讨表明治疗色素病有效的利用频率高的黑白两类中药共10味,以目前探讨技术较为成熟的酪氨酸酶、细胞增殖及黑素合成作为观察指标,探讨单味中药经活性炭脱色后对体外培养的人A375黑素瘤细胞黑素代谢的影响,以及采取中药血清学的策略探讨4种具有不同功效的复方含药血清对黑素代谢的影响,进一步探讨色象中药与色素代谢的相关性,为色象论述及临床辨证用药提供科学依据,为以后白癜风的辨证治疗提供实验依据,同时为中医药治疗色素病的探讨提供新的思路,以有效地指导临床。策略与内容1、通过查阅大量的文献资料及临床资料,并结合临床实践经验,在以往的探讨基础上,筛选出中医传统治验及现代探讨表明治疗色素病有效的利用频率高的中药,依据饮片的外在颜色分为黑(深色)、白(浅色)两组,每组各选5味药作为代表药,制备各单味中药水提液,取上面陈述的中药水提取液100ml,用紫光分光光度法进行测定吸光度值,采取正交试验法对每味中药的脱色工艺进行筛选,以最佳脱色条件进行脱色后取上清液过滤后备用,并用不含胎牛血清的培养基进行稀释,使药物终质量浓度为10μg/ml。2、参照医学实验动物学及中药血清学的策略,制备四种不同功效配伍的复方含药血清,并用不含胎牛血清的培养基进行稀释,使含药血清的终浓度为5%、10%、20%、30%,并以此四种浓度进行探讨。3、运用细胞培养学技术,将人A375黑素瘤细胞株进行体外培养。采取多巴速率氧化法测定黑白两组中药水提取液脱色前后、四种不同功效配伍的复方含药血清在不同浓度对细胞中酪氨酸酶活性的影响,采取四偶氮唑蓝(MTT)法测定黑白两组中药水提取液脱色前后、四种不同功效配伍的复方含药血清在不同浓度对细胞增殖的影响；采取NaOH裂解法测定黑白两组中药水提取液脱色前后、四种不同功效配伍的复方含药血清在不同浓度对细胞中黑素合成含量的影响。每种药物每个浓度设3个复孔,重复3次,并设对照组：单纯培养基组、中药对照组(培养基+中药)和空白对照组(培养基+细胞)3、运用SPSS13.0统计软件,分别采取单因素方差浅析的Dunnett检验和析因设计资料的方差浅析对单味中药和复方含药血清各组实验数据进行统计学处理与浅析,数据均以±s表示,以P0.05时表示差别有统计学作用。结果1、单味中药调节黑素代谢测定结果：①未经活性炭脱色的中药中,制首乌、补骨脂、丹参、鸡血藤、墨旱莲、桃仁对TYR活性具有激活作用(P≤0.05或P≤.01)；茯苓、白芷、白芨对TYR活性具有抑制作用(P≤0.05或P≤0.01)。而经活性炭脱色后,制首乌、墨旱莲对TYR活性无激活作用(P0.05),丹参、鸡血藤、补骨脂对TYR活性的激活作用显著降低,与未脱色组比较,差别具有显著性(P0.05或P0.01)。桃仁、茯苓、白芷、白芨、白术脱色前后比较,差别均无统计学作用(P0.05)。②与空白对照组比较,未经活性炭脱色的中药中,制首乌、补骨脂、丹参、鸡血藤、桃仁对黑素细胞增殖具有推动作用(P≤0.05或P≤0.01)；白芷、白芨、白术对黑素细胞增殖具有抑制作用(P≤0.01)。而经活性炭脱色后,丹参、鸡血藤对黑素细胞增殖无推动作用(P0.05),白术、白芨、补骨脂对黑素细胞抑制或推动作用显著降低,与未脱色组比较,差别具有显著性(P≤0.05),茯苓脱色后对黑素细胞增殖具有推动作用,与未脱色组比较,差别具有显著性(P≤0.01),桃仁、白芷、墨旱莲、白术脱色前后比较,差别均无统计学作用(P0.05)。③未经活性炭脱色的中药中,补骨脂、丹参、鸡血藤、桃仁对黑素细胞合成具有推动作用(P0.01)；白芨、白术对黑素细胞合成具有抑制作用(P≤0.05)。而经活性炭脱色后,桃仁、鸡血藤对黑素细胞合成无推动作用(P0.05),丹参、补骨脂对黑素细胞合成作用显著降低,与未脱色组比较,差别具有显著性(P0.05或P0.01),墨旱莲、茯苓脱色后对黑素细胞合成具有推动作用,与未脱色组比较,差别无统计学作用或具有显著性(P≤0.01),白芷脱色后对黑素细胞合成具有抑制作用,与未脱色组比较,差别具有显著性(P≤0.01),制首乌、白芨、白术脱色前后比较,差别均无统计学作用(P0.05)。2、复方含药血清对黑素瘤细胞黑素代谢测定结果：①相应浓度各方之间比较,含药血清浓度为5%时,与空白血清对照组比较,Ⅰ方、Ⅱ方、Ⅲ方对酪氨酸酶活性激活作用不显著,仅Ⅵ方含药血清对酪氨酸酶活性有显著激活作用(P=0.0140.05),Ⅵ方对酪氨酸酶的激活作用显著高于Ⅰ方、Ⅱ方(P=0.01和P=0.0040.01),与Ⅲ方作用无显著差别(P=0.2330.05)；含药血清浓度为10%时,各组之间比较差别无统计学作用(P=0.1240.05)。含药血清浓度为高浓度(20%-30%)时,与相应浓度空白血清对照组比较,Ⅰ、Ⅲ、Ⅵ方对A375细胞酪氨酸酶活性均有激活作用,以Ⅵ方作用最显著(P0.001),且与相应浓度的其它三方相比,差别有统计学作用(P0.001)。相应复方各浓度间比较：Ⅰ方各浓度间比较,随着浓度的增加,中药对酪氨酸酶的激活作用增强,20%与30%含药血清浓度对酪氨酸酶活性的影响无显著差别(P=0.2030.05),与5%和10%含药血清浓度激活作用比较,有显著差别(P0.01)。Ⅱ方各浓度间比较,5%、20%、30%含药血清浓度对酪氨酸酶的激活作用与10%含药血清浓度相比,均有显著差别(P0.05或P≤0.01),三种浓度间无显著差别(P=0.4840.05)。Ⅲ、Ⅵ方各浓度间比较差别均有显著作用(P0.01),中药对酪氨酸酶的激活作用随着含药血清浓度的增加而增强。②相应浓度各复方之间比较,含药血清浓度为低浓度5%-10%时,与空白血清对照组比较,各方对黑素增殖作用不显著,差别无统计学作用(P0.05)。含药血清浓度为20%时,与空白血清对照组比较,复方Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅵ方对黑素增殖均有显著推动作用,以Ⅵ方作用最显著(P0.001),且与同血清浓度的其它三方相比,差别均有显著统计学作用(P≤0.001)；含药血清浓度为30%时,与空白血清对照组比较,Ⅰ、Ⅲ、Ⅵ方对A375黑素瘤细胞黑素增殖有显著推动作用(P≤0.05或P≤0.01),各方之间比较,Ⅰ方、Ⅲ方与Ⅵ方比较,差别无统计学作用(P=0.4190.05),Ⅱ方与Ⅵ方相比,差别有统计学作用(P=0.0010.01)。相应复方各浓度间比较：Ⅰ方各浓度间比较,随着浓度的增加,中药对黑素增殖的推动作用增强,20%与30%含药血清浓度对黑素增殖的推动作用无显著差别(P=0.8310.05),与5%和10%含药血清浓度促增殖作用比较,均有显著差别(P0.01)。Ⅱ方各浓度间比较,10%、20%、30%含药血清浓度对黑素增殖的推动作用均高于5%含药血清浓度(P≤0.01),其中20%含药血清浓度推动作用最强,与其它浓度比较差别有统计学作用(P≤0.01)。Ⅲ方、Ⅵ方各浓度间比较,均以20%含药血清浓度促黑素增殖作用最强,与其它含药血清浓度比较,差别有显著统计学作用(P0.01)。③中药各复方之间推动黑素合成作用比较差别有显著统计学作用(P0.001),中药含药血清均能在一定程度上推动黑素合成,各复方对黑素合成推动作用高于空白血清对照组。复方Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ方之间比较,三者对黑素合成推动作用无显著差别(P=0.4800.05),Ⅵ方对黑素合成推动作用显著高于其它组。复方中药不同含药血清浓度对黑素合成推动作用比较差别有显著差别(P0.001),随着含药血清浓度的增加,各方对黑素合成推动作用增强,10%含药血清浓度对黑素合成的推动作用显著高于5%含药血清浓度,20%与30%含药血清浓度对黑素合成的推动作用显著高于5%、10%含药血清浓度,此两种浓度间比较无显著差别(P=0.9150.05)。结论1、经活性炭脱色后,黑色(深色)、白色(浅色)中药大部分失去或降低了对黑素代谢的推动或抑制作用,其中黑色药物更显著。说明药材颜色与色素代谢调节有着一定的相关性。2、具有祛风、活血和补肾三重作用的Ⅵ方在推动黑素代谢的作用上优于祛风除湿Ⅰ方、养血活血Ⅱ方和滋补肝肾Ⅲ方,含药血清浓度为高浓度时作用最显著。表明白癜风治疗以祛风、活血、补肾为基本治则效果最好,这为以后临床中白癜风以“祛风、活血、补肾”为基本治则,并结合分期论治的治疗案例提供了实验根据,对白癜风辨证论治及病因病机论述的进展都具有重要的指导作用。关键词：中药脱色论文色效相关论文含药血清论文黑素代谢论文
摘要3-9
ABSTRACT9-18
第一章 前言18-28
第二章 材料与策略28-38
1 实验材料28-33
2 实验策略33-37
3 统计学浅析37-38
第三章 结果与浅析38-53
1 单味中药脱色对黑素瘤细胞黑素代谢的影响38-48
2 复方含药血清对黑素瘤细胞黑素代谢的影响48-53
第四章 讨论53-65
1 中药色象论述的形成的论述基础53-55
2 中药脱色及色素代谢调节的实验探讨55-60
3 白癜风分期论治案例及含药血清的实验探讨60-64
4 探讨有着不足及展望64-65
全文小结65-67