摘要：肌内脂肪(Intramuscularfat, IMF)是肉质细嫩多汁和口感好的物质基础,IMF含量的增加可以使肌肉嫩度、多汁性和肉色得到提升。目前在对猪肉质的评定指标中,肌内脂肪的含量已经成为肉质指标中最关键的参数。但自二十世纪七十年代以来,国内外在瘦肉型猪的选育中一直侧重于对瘦肉率的选择提升,高瘦肉率的选择导致瘦肉型猪IMF含量降到了1.5%左右,低于了最适范围,极大地降低了猪肉品质。如何能在保证瘦肉率的前提下提升IMF含量,已成为育种者探讨的目标。PPARγ2在脂肪细胞分化,成熟中起着关键作用,探讨表明,PPARγ2决定哺乳动物的体脂分布,与肌肉中的脂肪含量有关。由此,本探讨以PPARγ2作为候选基因,构建了肌肉特异性真核表达载体,以细胞水平和转基因模型小鼠进行探讨细胞或肌肉超表达PPARγ2的影响,期望发现肌肉超表达PPARγ2和IMF以及其他指标的关联,为培育高品质瘦肉猪建立转基因模型。取得的主要探讨成果有：1.以真核表达载体pEGFP-N1为框架,以猪MCK基因的BAC中采取基因抓捕技术,钓取了7Kb的MCK启动子序列,构建载体pEGFP-N1L-MCK, SalI和NotI进行双酶切,得到大片段pEGFP-N1L-MCK。以人工合成的PPARy2cDNA全长质粒(pMD-18-PPARy2)为材料,分别用SalⅠ和Not I进行双酶切,得到基因PPARy2片段。将前面两部得到的大片段pEGFP-N1L-MCK和PPARy2cDNA进行连接,得到真核表达载体pEGFP-N1L-MCK-PPARy2.通过载体部分测序,PCR检测,以及BglⅡ的酶切鉴定无误,说明真核表达载体pEGFP-N1L-MCK-PPARy2构建成功。2.以猪35日龄胚胎为材料,培养出原代成纤维细胞系,并将构建好的真核表达载体pEGFP-N1L-MCK-PPARy2瞬时转染成纤维细胞和C2C12细胞,RT-PCR检测表明,PPARy2能够在成纤维细胞和C2C12超表达,并且使脂肪合成相关基因SCD2、LPL、ACC等表达上调。同时,将线性化的载体转染小鼠的成肌细胞C2C12,经G418筛选,获得稳定转染的细胞株,PCR检测阳性,RT-PCR检测表明,阳性细胞PPARy2较阴性细胞表达大幅增加。通过以上两种细胞转染实验可见MCK启动子能够带动PPARy2在成纤维细胞和成肌细胞中超表达。3.通过显微注射法得到阳性Founder小鼠5只,分别将阳性公母小鼠与阴性异性小鼠交配,生下F1代,对2周龄小鼠采取PCR技术检测出阳性小鼠。通过RT-PCR和Western Blot检测发现PPARy2在阳性小鼠骨骼肌和心肌高表达,肝脏,肾脏中等,脂肪,小肠,睾丸等表达量很少,这一结果与MCK在哺乳动物不同组织的表达相符,表明我们构建的真核表达载体能够在转基因小鼠中正常表达,也表明猪MCK启动子和小鼠MCK启动子一样,能够驱动基因在肌肉组织中超表达。4.我们对骨骼肌中脂肪合成,转运等相关基因通过Real Time PCR对mRNA检测发现脂肪相关基因表达得到不同程度的增加,如脂肪酸结合蛋白(FABP4) mRNA增加13倍,脂蛋白酯酶(LPL)增加1倍,DGAT1增加51%,脂肪酸合成酶(FAS)增加1.1倍,而能够降解脂肪的激素敏感脂肪酶(HSL)降低了62%。同时也发现SCD2表达减少。通过连续测定小鼠4-16周体重显示,转基因阳性小鼠体重与阴性小鼠差别不显著。通过对肌肉中甘油三酯的测定,阳性小鼠骨骼肌甘油三酯增加30%(p0.01),游离脂肪酸增加16%(p0.01),而血液中甘油三酯和血糖均差别不显著。我们对肌肉组织中脂肪酸组成进行了气相色谱测定,发现多不饱和脂肪酸C18：2、C20：4、C22：6增加,达到差别极显著水平。C16：1增加(P0.01)而C18：1减少(P0.01)。实验还对骨骼肌糖代谢相关基因进行检测,发现,葡萄糖转运蛋白1(Glut1),葡萄糖转运蛋白4(Glut4),磷酸葡萄糖异构酶(glucose phosphate isomerase1),果糖二磷酸酶(fructose bisphosphatase2),丙酮酸脱氢酶激酶1(pyruvate dehydrogenase kinase isoenzymel)等表达量增加,磷酸变位酶(phosphoglycerate mutase1)表达减少,糖元合成酶(glycogen synthase2)差别不显著。5.在试验中,对皮下脂肪和肌肉中的棕色脂肪相关基因进行检测,发现皮下脂肪中棕色脂肪特意基因UCP1无论在mRNA水平(157fold, P0.01),还是蛋白水平,都提升很多倍,另一个棕色脂肪基因PRDM16也增加了79%(P0.01),另外PGC1α (2.2fold, P0.01)、Cidea (21fold, P0.01)、Cox7a (7.4fold, P0.01)都不同程度的增加,且达到极显著水平。6.实验对肝脏脂肪相关基因进行了检测,发现肝脏中PPARy2增加8倍多,FAS增加210倍,DGAT1增加了93%,而HSL降低到了13%,FABP4增加了1倍多,说明肝脏合成多的脂肪酸和甘油三酯被转运到了其他组织,这与肝脏组织切片的HE染色结果一直,肝脏中脂肪变化差别不显著。关键词：MCK启动子论文肌内脂肪论文PPARγ2论文转基因小鼠论文真核表达载体论文超表达论文
摘要8-10
Abstract10-13
縮略词表13-15
第一章 文献综述15-34
1.1 转基因动物探讨策略与运用15-19
1.1.1 转基因动物制备策略15-17
1.1.2 转基因动物的运用17-19
1.1.3 展望19
1.2 肌内脂肪候选基因探讨19-27
1.2.1 脂肪酸合成酶(Fatty acid synthetase,FAS)20-21
1.2.2 激素敏感脂酶(Hormone-sensitive ppase,HSL)21
1.2.3 脂蛋白脂酶(Lipoprotein ppase,LPL)21-22
1.2.4 二酯酰甘油酰基转移(diaeylglyeerolaeyltraneras,DGAT)22-24
1.2.5 脂肪酸结合蛋白(fatty acid binding proteins,FABP)24-26
1.2.6 CD3626-27
1.3 PPARγ27-34
1.3.1 PPARγ概述27-34
第二章 pEGFP-N1L-MCK-sPPARγ2真核表达载体的构建34-53
2.1 探讨目的34
2.2 材料与策略34-36
2.2.1 主要仪器设备34
2.2.2 主要试剂与试剂盒34-35
2.2.3 主要溶液配方35-36
2.2.4 利用主要载体36
2.3 实验策略36-45
2.3.1 pEGFP-N1L-Tyb12载体的构建36-41
2.3.2 pEGFP-N1L-sMCK载体的构建41-43
2.3.3 最终载体pEGFP-N1L-MCK-PPARγ2的构建43-45
2.4 实验结果45-51
2.4.1 pEGFP-N1L-Tyb12载体的构建45-47
2.4.2 载体pEGFP-N1L-sMCK的构建47-48
2.4.3 最终载体pEGFP-N1L-MCK-PPARγ2的构建48-51
2.5 讨论51-53
第三章 转基因细胞系建立与检测53-67
3.1 实验目的53
3.2 实验材料53-54
3.2.1 实验动物53
3.2.2 仪器设备53
3.2.3 主要试剂和试剂盒53-54
3.2.4 主要试剂的配制54
3.3 实验策略54-60
3.3.1 猪35日龄胚胎成纤维细胞培养建系54-55
3.3.2 质粒大量提取55-56
3.3.3 细胞转染实验56-60
3.4 结果与浅析60-64
3.4.1 成纤维细胞原代培养60
3.4.2 瞬时转染猪胚胎成纤维细胞检测和转染C2C12细胞检测60-62
3.4.3 稳定转染C2C12细胞检测62-64
3.5 讨论64-67
3.5.1 关于成纤维细胞原代培养64
3.5.2 关于载体的转染实验64-67
第四章 转基因小鼠制备与表达检测67-93
4.1 实验目的67
4.2 实验材料67-70
4.2.1 实验动物67
4.2.2 主要仪器67
4.2.3 主要试剂与试剂盒67-68
4.2.4 主要试剂配方68-69
4.2.5 主要生物学网站以及浅析软件69
4.2.6 主要引物设计69-70
4.3 试验策略70-78
4.3.1 转基因小鼠获取和鉴定70
4.3.2 转基因小鼠PPARγ2的组织表达检测70-73
4.3.3 Western Blot73-74
4.3.4 检测PPARγ2上调对组织相关基因表达的影响浅析74-75
4.3.5 转基因小鼠部分生化指标测定75-78
4.4 实验结果78-84
4.4.1 转基因小鼠F1代检测78
4.4.2 转基因小鼠F1代PPARγ2组织表达检测78-79
4.4.3 PPARγ2上调对组织相关基因表达以及生化指标的影响浅析79-82
4.4.4 转基因小鼠部分生理生化指标测定82-84
4.5 讨论84-93
4.5.1 转基因小鼠检测84-86
4.5.2 超表达PPARγ2对骨骼肌的影响86-89
4.5.3 超表达PPARγ2对皮下脂肪的影响89-91
4.5.4 超表达PPARγ2对肝脏的影响91-93
第五章 结论93-95
5.1 主要探讨成果93
5.2 主要革新点93-94
5.3 探讨的不足之处94-95
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