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摘要：帕金森病（Parkinson’s disease，PD）是一种常见的中枢神经系统变性疾病，以黑质多巴胺能神经元慢性进行性缺失为主要病理特点，最终导致纹状体内多巴胺神经递质耗竭。尽管PD发病机理仍未阐明，但大量探讨证实氧化应激在本病发病中起主要作用。活性氧物质和线粒体相互作用触发了线粒体死亡途径，这种方式被认为是PD中氧化应激介导细胞凋亡的主要方式。1--4-吡啶（1-methyl-4-phenylpyridiniumion, MPP~+）诱导PC12细胞是体外探讨PD可靠的细胞模型。PC12细胞是大鼠肾上腺嗜铬细胞瘤细胞，能够产生多巴胺，并具有多巴胺转运系统，可作为细胞模型探讨多巴胺能神经元的变性。1--4--1,2,3,6-四氢吡啶(1-methyl-4-phenyl-1,2,3,6-tetrahydropyridine, MPTP）是一种神经毒素，可选择性地损害多巴胺能神经元并在人类及哺乳动物中引起类似PD的病理转变及临床症状。MPTP为脂溶性物质，极易透过血脑屏障，在星形胶质细胞内由B型单胺氧化酶催化生成其代谢产物MPP~+，MPP~+具有神经毒性，可选择性地引起多巴胺能神经元变性死亡。MPP~+引起多巴胺能神经元变性的确切机制尚未完全阐明，可能是活性氧物质生成及氧化应激触发了多巴胺能神经元的变性死亡。目前，PD治疗主要以多巴胺替代治疗为主，此类药物虽能缓解PD症状，但并不能制约多巴胺能神经元持续变性。如何有效地抑制多巴胺能神经元持续变性已成为本病治疗的焦点。探讨已证实神经系统变性疾病与氧化应激密切相关，减弱氧化应激可产生神经保护作用。硫辛酸又名1,2-二硫戊环-3-戊酸，通过清除活性氧物质及螯合重金属而体现出较强的抗氧化活性。这些作用均有利于改善与氧化应激有关的疾病包括PD。此外，亦有报道证实硫辛酸在一系列细胞及组织中具有抗炎及增加谷胱甘肽(glutathiose，GSH)形成的作用，这对PD亦有积极影响。硫辛酸作为抗氧化应激药物已运用于临床与氧化应激相关疾病的治疗，且治疗剂量副作用很小。为验证α-硫辛酸（α-ppoic acid，LA）是否对MPP~+诱导PC12细胞损伤具有防护作用，我们采取MTT实验测定细胞活力，运用AO/EB染色以凋亡角度浅析LA防护MPP~+诱导的PC12细胞凋亡，并通过2',7'-二氯荧光黄双乙酸盐（2',7'-dichlorofluorescein-diacetate，DCFH-DA）利用流式细胞仪验证LA对MPP~+诱导PC12细胞活性氧簇（Reactive oxygen species,ROS）生成的影响。接着，我们采取蛋白质组学策略浅析LA防护MPP~+诱导PC12细胞损伤的蛋白表达水平变化。结果显示：单独加入LA对细胞活力无显著影响；500μM MPP~+作用72h，PC12细胞活力显著下降；提前1h加入0.01μM LA与损害组相比细胞活力显著增加。凋亡染色亦证实0.01μM LA可显著减少由MPP~+诱导的细胞凋亡，进一步证实了LA可对抗MPP~+的神经毒性作用。结果还显示MPP~+单独作用PC12细胞组2',7'-二氯荧光黄（2',7'-dichlorofluorescein，DCF）荧光密度显著增强，提前加入LA可有效抑DCF荧光强度，说明LA可有效抑制MPP~+诱导PC12细胞的ROS生成。运用蛋白质组学策略，成功的鉴定出4个表达具有显著差别的蛋白，分别是增殖细胞核抗原（propferating cell nuclear antigen,PCNA）、膜联蛋白A2(annexin A2)、鸟嘌呤核苷酸结合蛋白(i)α亚单位(guanine nucleotide-bingdingprotein Gi subunit alpha,Giα)、O-唾液酸糖蛋白内肽酶（O-sialoglycoproteinendopeptidase,OSGEP），以分子水平探讨了LA对MPP~+诱导PC12细胞凋亡作用的保护机制，为PD有效的药物治疗提供了论述基础。关键词：帕金森病论文PC12细胞论文1--4-吡啶论文α-硫辛酸论文蛋白质组学论文
前言4-6
中文摘要6-8
Abstract8-12
英文缩写词表12-14
第1章 绪论14-26
1.1 引言14-15
1.2 文献综述15-26
1.2.1 帕金森病病因15-19
1.2.2 帕金森病发病机制19-21
1.2.3 硫辛酸生物学活性21-24
1.2.4 展望24-26
第2章 α-硫辛酸对 MPP~+诱导 PC12 细胞毒性损伤的防护作用26-40
2.1 前言26-27
2.2 材料与策略27-33
2.2.1 材料27-29
2.2.2 试剂配制29-31
2.2.3 实验策略31-33
2.3 统计学浅析33
2.4 实验结果33-37
2.4.1 MPP~+对 PC12 细胞的毒性作用33-34
2.4.2 LA 对神经毒性药物作用 PC12 细胞的保护作用34-35
2.4.3 LA 有效抑制了 MPP~+诱导 PC12 细胞的凋亡35-36
2.4.4 LA 有效地抑制了 ROS 的生成36-37
2.5 讨论37-39
2.6 结论39-40
第3章 α-硫辛酸对帕金森病细胞模型保护作用的蛋质组学探讨40-70
3.1 前言40-41
3.2 材料与策略41-53
3.2.1 材料41-43
3.2.2 试剂配制43-47
3.2.3 实验策略47-53
3.3 实验结果53-65
3.3.1 差别蛋白浅析53-54
3.3.2 差别表达蛋白的质谱鉴定结果54-64
3.3.3 2D-Western blot 验证质谱鉴定结果64-65
3.4 讨论65-69
3.5 结论69-70
第4章 结论70
革新点70-72