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摘要：目的：预先给予短暂、轻微、不至于引起神经元损伤的脑缺血预处理，可以减少缺血-再灌注损伤，产生脑缺血耐受。脑缺血预处理诱导脑缺血耐受，已被大量的探讨所证实，但其发生机制至今尚未阐明。NF-κB是以B淋巴细胞核中检测到的一种能与免疫球蛋к轻链基因的增强子κB序列特异结合的核蛋白因子。非活化状态NF-κB以IκB聚合的三聚体形式或与前体蛋白聚合的二聚体形式有着于胞浆中，在缺血缺氧等刺激作用下，通过多种信号途径IκB发生磷酸化并与NF-κB解聚，NF-κB被激活，将信息以胞浆传至胞核并启动相关靶基因的转录。此外，有的探讨发现，还有一些独立于IκB的信号，如p38MAPK可以对NF-κB进行磷酸化修饰，调节其活性，使其更有效地推动基因转录[12]。我室既往探讨发现，脑缺血预处理通过p38MAPK通路上调星形胶质细胞谷氨酸转运体-1（gpalglutamate transporter-1, GLT-1）大量表达而诱导脑缺血耐受；NF-κB的特异性抑制剂BAY11–7082剂量依赖性阻断脑缺血预处理所诱导的脑缺血耐受。但脑缺血预处理是否通过p38MAPK信号转导途径影响NF-κB信号通路而引起GLT-1的大量表达，尚有待阐明。为此，本实验旨在观察NF-κB在脑缺血预处理激活p38MAPK上调GLT-1表达诱导脑缺血耐受中是否发挥作用。策略：健康雄性Wistar大鼠（280～320g）198只，首先永久凝闭椎动脉，恢复2天后，随机分为以下三部分：1脑缺血预处理诱导脑缺血耐受历程中NF-κB p50、NF-κB p50/p65二聚体复合物、NF-κB DNA结合活性的变化具体分组如下：①s ham组(n=27)：只暴露双侧颈总动脉，不阻断血流；②脑缺血预处理（cerebral ischemic preconditioning, CIP）组(n=27)：夹闭双侧颈总动脉3min，然后恢复血流再灌注；③损伤性缺血（ischemicinsult, II）组(n=27)：夹闭双侧颈总动脉8min，然后恢复血流再灌注；④C IP+II组(n=27)：夹闭双侧颈总动脉3min作为脑缺血预处理，再灌注2天后，夹闭双侧颈总动脉8min作为损伤性缺血，然后恢复再灌注。各组均分为9个时间点，即检测手术或末次缺血后0min、15min、30min、3h、6h、1d、2d、4d、7d（每个时间点n=3）。在规定的时间点，断头取海马脑组织，运用western blot策略来观察NF-κB p50蛋白表达的变化，免疫共沉淀（Co-immunoprecipitation）策略来观察NF-κB p50/p65二聚体复合物表达的变化，采取电泳迁移率变动浅析（electrophoretic mobipty shift assay, EMSA）观察NF-κB DNA结合活性的变化。2p38MAPK的特异性抑制剂SB203580对脑缺血预处理诱导脑缺血耐受历程中NF-κB p50、NF-κB p50/p65二聚体复合物、NF-κB DNA结合活性的影响具体分组如下：①D MSO+CIP+II组（n=18）；②SB203580+CIP+II（n=18）。脑缺血预处理前30min侧脑室注射3%DMSO或SB2035805nmol，然后夹闭双侧颈总动脉3min作为脑缺血预处理，再灌注2天后，再次夹闭双侧颈总动脉8min作为损伤性缺血，而后恢复再灌注。于末次缺血后即刻（0min）、3h、6h、1d、4d、7d时取海马脑组织（每个时间点n=3），探讨p38MAPK信号转导通路对NF-κB p50蛋白、NF-κB p50/p65二聚体复合物、NF-κB DNA结合活性的影响。3NF-κB的特异性抑制剂BAY11–7082对脑缺血预处理诱导脑缺血耐受历程中GLT-1蛋白表达的影响具体分组如下：①D MSO+CIP+II组（n=18）；②BAY11–7082+CIP+II（n=36）。脑缺血预处理前30分钟侧脑室注射3%DMSO或BAY11–7082，再灌注2天后，夹闭双侧颈总动脉8min作为损伤性缺血，而后恢复再灌注。根据BAY11–7082剂量不同，又分成1.25nmol、2.5nmol2个亚组，每个亚组n=18。于末次缺血后即刻（0min）、3h、6h、1d、4d、7d时取海马脑组织（每个时间点n=3），采取Western blot法观察GLT-1蛋白的表达，探讨NF-κB的特异性抑制剂BAY11–7082对GLT-1蛋白表达的影响。结果：1脑缺血预处理诱导脑缺血耐受历程中NF-κB p50的表达及SB203580对其影响采取Western blot策略观察了在脑缺血耐受诱导历程中，大鼠海马CA1区NF-κB p50蛋白的的表达。Sham组，即刻（0min）时间点NF-κB p50有一定量的表达，但表达量较少。与即刻时间点相比，其余各时间NF-κB p50表达量均未发生显著变化（P0.05）。CIP组3min全脑缺血后，即刻（0min）时间点NF-κB p50蛋白的表达量较少。与即刻时间点相比，15min、30min时间点其表达有所上调，但差别无显著性（P0.05）；3h、6h时间点其表达显著升高（P 0.05）；其余时间点均无显著差别（P0.05）。缺血打击组在全脑缺血8min后，NF-κB p50在即刻时间点既有一定量的表达。与即刻时间点相比，在15min时间点NF-κB p50蛋白表达有所上调（P 0.05），30min时间点达到高峰（P 0.01）；3h、6h、1d、2d时间点此蛋白的表达有所下调，但仍显著高于即刻时间点（P 0.05）；4d、7d时间点NF-κB p50的表达与即刻时间点相比无显著差别（P0.05）。在DMSO+CIP+II组，0min、3h、6h、1d、4d、7d等6个时间点NF-κB p50的表达均较高。与DMSO+CIP+II组各个相应时间点相比，SB203580+CIP+II组NF-κB p50蛋白的表达在各个时间点均显著降低（P0.05）。表明， p38MAPK的特异性抑制剂SB203580能够有效抑制脑缺血耐受诱导历程中NF-κB p50的上调。2脑缺血预处理诱导脑缺血耐受历程中NF-κB p50/p65二聚体复合物的表达及SB203580对其影响通过免疫共沉淀（Co-immunoprecipitation）的策略探讨了脑缺血耐受诱导历程中，大鼠海马CA1区NF-κB p50/p65二聚体复合物的表达。Sham组NF-κB p50/p65二聚体复合物在0min、15min、30min、3h、6h时间点有一定数量的表达。与0min时间点相比，15min、30min、3h、6h时间点p50/p65二聚体复合物的表达有所上调，但差别无显著性（P0.05）；检测手术1d后NF-κB p50/p65二聚体复合物的表达显著下调。CIP组3min全脑缺血后，即刻（0min）时间点NF-κB p50/p65二聚体复合物的表达量较少。与即刻时间点相比，此二聚体复合物的表达在15min时间点显著上调（P＜0.01）。30min、3h虽有所下降，但仍显著高于即刻时间点（P＜0.05）。6h、1d、2d表达量维持在一定水平，与即刻时间点相比无显著差别（P0.05）。4d、7d时此二聚体复合物的表达比即刻时间点显著减少（P 0.05）。缺血打击组在全脑缺血8min后，即刻（0min）时间点NF-κB p50/p65二聚体复合物的表达量较少。与即刻时间点相比，NF-κB p50/p65复合物在15min、30min、3h表达显著升高（P 0.05），p50/p65核转移显著增强，以30min最为显著。其余时间点与即刻时间点相比，均无显著性差别（P0.05）。在CIP+缺血打击组，即刻（0min）时间点NF-κB p50/p65二聚体复合物有一定的表达量，但表达量较少。与即刻时间点相比，此二聚体复合物在15min、30min、3h、6h表达显著上调（P 0.01）；1d、2d时间点其表达虽有所下调，但仍显著高于即刻时间点（P 0.05）。4d、7d时此二聚体复合物的表达与即刻时间点相比，均无显著性差别（P0.05）。在DMSO+CIP+II组中，0min、3h、6h、1d、4d、7d等6个时间点NF-κB p50/p65二聚体复合物表达均较高。与DMSO+CIP+II组各个相应时间点相比，SB203580+CIP+II组的NF-κB p50/p65二聚体复合物的表达在各个时间点均显著降低（P 0.05）。上面陈述的结果表明，5nmol p38MAPK的特异性抑制剂SB203580能够有效阻断脑缺血耐受诱导历程中核内NF-κB p50/p65二聚体数量的上调。3脑缺血预处理诱导脑缺血耐受历程中NF-κB的DNA结合活性及SB203580对其影响我们采取电泳迁移率变动浅析（electrophoretic mobipty shift assay,EMSA）的策略检测大鼠海马CA1区胞核内NF-κB的DNA结合活性。在CIP组，即刻（0min）时间点NF-κB具有一定的DNA结合活性。与即刻时间点相比，NF-κB在15min时活性显著增强，并且达到高峰（P＜0.01）。30min、3h虽有所下降，但仍显著高于即刻时间点（P＜0.05）。6h、1d、2d时结合活性维持在一定水平，与即刻时间点相比无显著差别（P0.05）。4d、7d时NF-κB结合活性比即刻时间点显著降低（P 0.05）。缺血打击组在全脑缺血8min后，即刻（0min）时间点NF-κB具有一定的DNA结合活性。与即刻时间点相比，大鼠海马CA1区NF-κB活性在15min、30min、3h显著增强（P＜0.01），以30min较为显著；其余时间点均无显著差别（P0.05）。在CIP+缺血打击组，CIP+缺血打击组NF-κB的DNA结合活性。即刻（0min）时间点NF-κB具有一定的DNA结合活性。与即刻时间点相比NF-κB活性在15min开始增强，于30min、3h显著增强（P 0.01），在6h达到高峰；1d、2d时间点虽有所降低，但仍显著高于即刻时间点（P 0.05）。4d、7d时间点NF-κB活性与即刻时间点相比无显著差别（P0.05）。在DMSO+CIP+II组中，0min~7d的各个时间点NF-κB的DNA结合活性均较高。与DMSO+CIP+II组各个相应时间点相比，SB203580+CIP+II组的NF-κB的活性在各个时间点均显著降低（P 0.01）。上面陈述的结果表明，5nmol p38MAPK的特异性抑制剂SB203580能够有效阻断脑缺血耐受诱导历程中核内NF-κB的DNA结合活性上调。4脑缺血预处理诱导脑缺血耐受历程中NF-κB的特异性抑制剂BAY11–7082对GLT-1蛋白表达的影响采取Western blot策略观察了在脑缺血耐受诱导历程中，NF-κB的特异性抑制剂BAY11–7082对GLT-1蛋白表达的影响。在DMSO+CIP+II组，0min、3h、6h、1d、4d、7d共6个时间点GLT-1的表达均较高。与DMSO+CIP+II组各个相应时间点相比，1.25nmolBAY11–7082+CIP+II组GLT-1蛋白的表达在各个时间点均显著降低（P 0.05）。2.5nmol BAY11–7082亦导致GLT-1蛋白的表达在各个时间点均显著降低（P 0.05）。上面陈述的结果表明，NF-κB的特异性抑制剂BAY11–7082能够显著下调GLT-1的表达。小结：1在体脑缺血预处理诱导脑缺血耐受历程中，NF-κB被激活，即体现为：NF-κB p50蛋白表达上调；NF-κB发生二聚体化，并由胞浆转位至胞核；NF-κB的DNA结合活性增强。2p38MAPK的特异性抑制剂SB203580下调该历程中NF-κB p50蛋白的表达、下调NF-κB p50/p65的表达二聚体复合物的表达、抑制NF-κB的DNA结合活性。3NF-κB的特异性抑制剂BAY11–7082通过抑制NF-κB的活化来阻断脑缺血预处理所诱导的GLT-1表达上调。结论：NF-κB在脑缺血预处理激活p38MAPK上调GLT-1表达诱导脑缺血耐受中发挥作用。关键词：脑缺血预处理论文脑缺血耐受论文核转录因子(NF-κB)论文p38MAPK论文GLT-1论文电泳迁移率变动浅析论文免疫共沉淀论文蛋白印迹论文大鼠论文
摘要4-10
ABSTRACT10-17
前言17-19
材料与策略19-34
结果34-38
附图38-54
讨论54-57
小结57
结论57-58