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摘要：目的：在我国，近年来随着科技的进步以及我国人口老龄化进程的不断进展，非感染性疾病正越来越严重地危害国人健康，其中脑血管病的多发，使得血管性痴呆（Vascular Dementia,VD）的发病率迅速增加，并且血管性痴呆发病率随着年龄增加而直线上升，所以VD越来越受到人们的关注。由于VD是脑血管病后的主要并发症，不仅给患者本人带来长期的痛苦，严重的影响其生活质量，而且也给整个家庭和社会造成沉重的负担。目前国内外关于VD的治疗，尚无特效疗法。现代医学主要是通过降低脑血管病的危险因素，对于临床有脑血管病危险因素的患者，进行早期一级预防，以预防脑血管病和VD的发生。对于已发生VD的患者，除积极治疗脑血管病外，常给予钙离子拮抗剂、抗自由基药物、胆碱酯酶抑制剂、制约行为和精神症状等药物，以延缓病情进展，缓解其症状，提升患者的生活质量。由此充分发挥中医药整体观念，辨证论治特点优势，将对血管性痴呆治疗具有重要作用。本探讨课题是在导师王四平教授的指导下，依据中医基础论述，通过细胞生物学实验探讨，以连二亚硫酸钠（Na2S2O4）损伤人神经母细胞瘤SK-N-SH细胞为神经细胞缺氧损伤模型，以以姜黄中提取的姜黄提取物结晶体（包括姜黄素、去甲氧基姜黄素、双脱甲氧基姜黄素）对SK-N-SH细胞损伤保护及凋亡的影响，探讨姜黄的有效部位——姜黄提取物对SK-N-SH细胞缺氧损伤的保护作用；并探讨其治疗血管性痴呆的机理，为临床用药提供论述根据。策略：本实验采取的是细胞生物学策略，实验时共分五组，分别为：对照组、模型组、20μmol L-1姜黄提取物组（低剂量组）、40μmol L-1姜黄提取物组（中剂量组）、80μmol L-1姜黄提取物组（高剂量组）。各给药组预保护1h，后加入连二亚硫酸钠（Na2S2O4），均给予缺氧损伤处理。使其终浓度为5mmol/L，继续培养8h、16h、24h，进行细胞形态观察；利用MTT比色法检测不同培养时间细胞存活率；乳酸脱氢酶（LDH）活性测定；分光光度法检测细胞培养液内超氧化物歧化酶(SOD)活性及丙二醛(MDA)含量；并运用Western blotting策略检测细胞Caspase-3活性变化。结果：1.形态学观察倒置相差显微镜下观察各组SK-N-SH细胞生长及形态的变化。结果显示：倒置显微镜下SK-N-SH细胞形状呈圆形，椭圆形，梭形，不规则形，较少有突起，且圆形较多，为贴壁细胞，折光性较强，生长速度较快，培养3d后细胞生长成簇。SK-N-SH细胞在5mmol/L Na2S2O4作用下有显著的损伤，镜下可见细胞数目减少，突起消失，肿胀圆缩，折光性下降，贴壁能力降低，细胞胞体逐渐减小，胞体内颗粒逐渐增加，可以看到大部分细胞已经死亡，部分细胞裂解成碎片；给予姜黄提取物各组均能显著减轻缺氧环境下的SK-N-SH细胞形态学的变化，体现为细胞折光性较好，细胞碎片形成减少，细胞胞体逐渐增大，胞体内颗粒逐渐减少。2. MTT法细胞存活力测定结果显示：各组细胞培养8h的OD值分别为：对照组0.77±0.03、模型组0.12±0.01、低剂量组0.22±0.01、中剂量组0.27±0.01、高剂量组0.34±0.03；各组16h的OD值分别为：对照组0.83±0.04，模型组0.19±0.01、低剂量组0.25±0.01、中剂量组0.31±0.01、高剂量组0.41±0.02；各组24h的OD值分别为：对照组1.13±0.04、模型组0.19±0.01、低剂量组0.25±0.01、中剂量组0.34±0.01、高剂量组的为0.44±0.03。姜黄提取物三个剂量（20μmol L-1、40μmol L-1、80μmol L-1）组的OD值较模型组显著增高，与模型组比较有显著性差别（P0.01）。3.乳酸脱氢酶（LDH）活性测定结果显示：各组LDH值分别为：对照组370.61±35.96U/L、模型组1000.77±16.78U/L、低剂量组735.52±44.0U/L、中剂量组571.31±37.00U/L、高剂量组467.34±91.23U/L。姜黄提取物三个剂量（20μmol L-1、40μmol L-1、80μmol L-1）中的LDH漏出量显著减少，与模型组比较有显著性差别（P0.01），抑制了LDH的释放，并且是随着剂量的增加LDH的释放逐渐减少，与剂量呈负相关。4.姜黄提取物对SK-N-SH细胞缺氧损伤后细胞外SOD、MDA的影响结果显示，各组SOD值分别为：对照组14.62±0.41U/L、模型组10.62±0.43U/L、低剂量组12.86±0.30U/L、中剂量组13.71±0.27U/L、高剂量组13.99±0.38U/L。各组MDA值:对照组3.39±0.33U/L、模型组6.11±1.04U/L、低剂量组4.08±0.63/L、中剂量组3.79±0.42U/L、高剂量组3.63±1.15U/L。与正常对照组相比，模型组细胞培养液内的MDA水平均显著升高(P＜0.01)、而细胞培养液内的SOD水平均显著下降(P＜0.01)；与模型组组相比，姜黄提取物低、中、高浓度组均可使SK-N-SH细胞培养液内的MDA水平均显著降低(P＜0.01)、而使细胞培养液的SOD水平均显著升高(P＜0.01)，结果显示：姜黄提取物能够抑制SK-N-SH细胞的缺氧损伤。5.姜黄提取物对缺氧诱导SK-N-SH损伤模型细胞Caspase-3活性的影响：通过Western blot检测法检测Caspase-3蛋白的表达情况：与正常对照组相比，连二亚硫酸钠（Na2S2O4）诱导组细胞Caspase-3活性升高；与连二亚硫酸钠（Na2S2O4）诱导组相比，姜黄提取物低、中、高浓度组均可使SK-N-SH细胞Caspase-3活性下降。结论：1、姜黄提取物对SK-N-SH细胞的缺氧损伤具有保护作用。2.姜黄提取物对SK-N-SH细胞缺氧损伤的保护作用是通过抑制凋亡和抗氧化作用实现的。3、为姜黄提取物治疗血管性痴呆提供了论述依据和实验基础。关键词：姜黄提取物论文血管性痴呆论文Caspase-3论文SK-N-SH细胞论文乳酸脱氢酶论文丙二醛论文超氧物歧化酶论文
摘要4-7
ABSTRACT7-11
前言11
材料与策略11-16
结果16-19
附图19-23
附表23-25
讨论25-29
结论29-30