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简论素羟基红花素A调控线粒体抗心肌缺血—再灌注损伤作用实验

收藏本文 2024-02-01 点赞:7848 浏览:22140 作者:网友投稿原创标记本站原创

摘要:目的:通过外科手术的策略建立大鼠心肌缺血再灌注损伤的模型,探讨HSYA抗心肌缺血-再灌注损伤的作用及机制。策略:(1)外科手术的策略建立心肌缺血-再灌注损伤模型,并给予HSYA治疗;利用生物化学法分别检测血清CK、LDH、SOD和GSH-Px活力,血清MDA及组织匀浆H2O2和NO的含量;利用Fluo-3染色,流式细胞术检测细胞内钙离子浓度;分别利用Annexin Ⅴ-FITC凋亡检测试剂盒、流式细胞术和TUNEL法检测细胞凋亡;Western blotting检测LC3蛋白的表达,以LC3Ⅱ/LC3Ⅰ变化表示自噬。(2)Western blotting法检测线粒体和细胞浆中Cyt c表达;检测线粒体内缝隙连接蛋白Cx43的表达;检测心肌细胞中凋亡相关因子Bcl-2和Bax表达以及caspase-3的激活;检测心肌细胞内自噬相关蛋白Becpn1和Agt5的表达;检测PI3K-Akt信号通路中Akt的表达;以及利用ELISA检测组织匀浆中eNOS的表达。结果:(1)心肌缺血-再灌注1h和24h,与检测手术组比较,血清CK和LDH释放增加,血清MDA和组织匀浆中H2O2和NO的含量增加,血清SOD和GSH-Px活力降低,细胞内钙离子浓度显著增加;流式细胞术和TUNEL法结果均显示心肌细胞凋亡增加,而LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值增加,则暗示自噬增加,这些指标均以再灌注24h变化更显著;(2)Western blotting结果显示,心肌缺血-再灌注1h和24h,与检测手术组比较,心肌细胞线粒体内Cyt c表达降低,而胞浆中Cyt c表达升高,心肌细胞中Bcl-2表达降低,Bax表达升高,且caspase-3被激活;心肌细胞中与钙离子调控相关的PMCA和SERCA表达均降低;缝隙连接蛋白Cx43表达降低;自噬相关蛋白Becpn1和Atg5表达增加,磷酸化的Akt和eNOS活性降低,而Akt表达变化不大,这些蛋白的表达以再灌注24h变化更显著。(3)心肌缺血-再灌注1h和24h模型大鼠经过HSYA治疗后,血清CK和LDH释放减少,血清MDA和组织匀浆中H2O2含量降低,血清SOD和GSH-Px活力增加,但是匀浆中NO含量增加,细胞中钙离子浓度降低,细胞凋亡和自噬降低;(4)Western blotting结果显示,心肌缺血-再灌注1h和24h模型大鼠经过HSYA治疗后,线粒体内Cyt c表达增加,而细胞浆中Cyt c表达降低,Bcl-2表达升高,Bax表达降低,caspase-3的激活被抑制,SERCA表达升高,而PMCA表达变化不显著,Becpn1和Atg5表达降低,磷酸化的Akt和eNOS活性升高,而Akt表达无显著变化。结论:(1)心肌缺血-再灌注损伤导致大鼠血清CK和LDH释放增加,心肌细胞氧化损伤增强、抗氧化能力减弱、钙超载、凋亡和自噬增加,且以再灌注24h损伤更严重;(2)HSYA具有抗心肌缺血-再灌注损伤作用;(3)HSYA抗心肌缺血-再灌注引起的钙超载由SERCA调控,而非PMCA调控;(4)HSYA抗心肌缺血-再灌注损伤可能和升高Cx43表达,进而抑制细胞内活性氧的生成有关;(5)HSYA抑制心肌缺血-再灌注诱导细胞凋亡涉及到线粒体通路的激活,并可能由Bcl-2/Bax调控;(6)HSYA抑制心肌缺血-再灌注诱导细胞自噬可能通过其降低Becpn1和Agt5表达和激活pAkt-eNOS通路有关。关键词:心肌缺血-再灌注论文羟基红花素A论文凋亡论文自噬论文Cx43论文线粒体论文

    中文摘要4-6

    Abstract6-12

    英文缩略词12-14

    前言14-16

    第1章 绪论16-44

    1.1 缺血─再灌注损伤的病理转变和体现17-19

    1.1.1 心肌细胞的损伤17

    1.1.2 微血管受损和无血流现象17-18

    1.1.3 心肌代谢的转变18

    1.1.4 主要临床体现18-19

    1.2 缺血─再灌注损伤的发生机制19-34

    1.2.1 钙超载20-22

    1.2.2 中性粒细胞浸润22-23

    1.2.3 自由基的作用23-24

    1.2.4 细胞凋亡24-28

    1.2.5 细胞自噬28-33

    1.2.6 线粒体 Cx43 与心肌缺血-再灌注33-34

    1.3 缺血-再灌注损伤防治措施34-39

    1.3.1 自由基清除剂及抗氧化剂34-35

    1.3.2 Ca~(2+)拮抗剂和通道抑制剂35-36

    1.3.3 心肌预适应36

    1.3.4 增加心肌供血和供氧、改善心肌舒缩功能的药物36-37

    1.3.5 抑制炎症及免疫的药物37

    1.3.6 心肌缺血的基因治疗37-38

    1.3.7 心肌缺血的干细胞治疗38-39

    1.4 羟基红花素 A 探讨进展39-44

    1.4.1 HSYA 的理化特性及稳定性39-40

    1.4.2 HSYA 对心血管系统的作用40-42

    1.4.3 立题依据及展望42-44

    第2章 心肌缺血-再灌注损伤模型建立及主要损伤44-66

    2.1 材料与策略44-58

    2.1.1 主要试剂及器材44-45

    2.1.2 主要仪器45

    2.1.3 实验动物及分组45-46

    2.1.4 大鼠心肌缺血-再灌注损伤模型建立46-47

    2.1.5 大鼠血清中肌酸激酶(CK)和乳酸脱氢酶(LDH)活性的变化47

    2.1.6 大鼠血清中 MDA 含量、SOD 活力和 GSH-Px 活力的变化47-48

    2.1.7 大鼠心肌组织中 H_2O_2和 NO 含量的变化48-50

    2.1.8 大鼠心肌细胞中[Ca~(2+)]i 的变化50

    2.1.9 大鼠心肌细胞凋亡的变化50-53

    2.1.10 Western blotting 检测凋亡和自噬相关蛋白的表达53-57

    2.1.11 统计学处理57-58

    2.2 实验结果58-64

    2.2.1 缺血再灌注大鼠血清 LDH 和 CK 活性的变化58

    2.2.2 缺血再灌注大鼠血清 MDA 浓度、SOD 和 GSH-Px 活力的变化58-60

    2.2.3 缺血再灌注大鼠心肌细胞中 NO 及 H2O2浓度的变化60

    2.2.4 缺血再灌注大鼠心肌细胞内钙离子浓度的变化60-61

    2.2.5 缺血再灌注大鼠心肌细胞凋亡的变化61-63

    2.2.6 缺血再灌注大鼠心肌细胞自噬的变化63-64

    2.3 小结64-66

    第3章 HSYA 抗心肌缺血-再灌注损伤的作用66-78

    3.1 材料与策略66-67

    3.1.1 主要试剂及器材66

    3.1.2 HSYA 对 SD 心肌缺血-再灌注损伤模型大鼠的治疗66

    3.1.3 实验动物及分组66

    3.1.4 心肌缺血-再灌注损伤模型建立66

    3.1.5 HSYA 对模型大鼠的治疗66-67

    3.1.6 实验策略67

    3.1.7 统计学处理67

    3.2 实验结果67-76

    3.2.1 HSYA 对缺血再灌注大鼠血清 LDH 和 CK 的活性的影响67-68

    3.2.2 HSYA 对缺血再灌注大鼠血清 MDA 浓度、SOD 和 GSH-Px活力的影响68-70

    3.2.3 HSYA 对缺血再灌注大鼠心肌细胞中 NO 及 H2O2浓度的影响70-71

    3.2.4 HSYA 对缺血再灌注大鼠心肌细胞内钙离子浓度的影响71-72

    3.2.5 HSYA 对缺血再灌注大鼠心肌细胞凋亡变化的影响72-74

    3.2.6 HSYA 对缺血再灌注大鼠心肌细胞自噬变化的影响74-76

    3.3 小结76-78

    第4章 HSYA 抗心肌缺血-再灌注损伤作用的机制78-94

    4.1 材料与策略78-83

    4.1.1 实验试剂及器材78-79

    4.1.2 主要仪器79

    4.1.3 实验动物及分组79

    4.1.4 动物模型建立及 HSYA 治疗79

    4.1.5 ELISA 检测组织匀浆中 eNOS 的表达79-81

    4.1.6 Western blotting 检测凋亡和自噬相关蛋白的表达81-82

    4.1.7 统计学处理82-83

    4.2 实验结果83-92

    4.2.1 HSYA 对 IRI 大鼠心肌细胞钙离子 ATP 酶的影响83-84

    4.2.2 HSYA 对 IRI 大鼠心肌细胞线粒体内 Cx43 蛋白表达的影响84-85

    4.2.3 HSYA 对 IRI 大鼠心肌细胞凋亡相关因子表达的影响85-89

    4.2.4 HSYA 对 IRI 大鼠心肌细胞自噬相关基因 Becpn-1 和 Atg5 蛋白表达的影响89-90

    4.2.5 HSYA 对 IRI 大鼠心肌细胞 Akt 及 eNOS 活性的影响90-92

    4.3 小结92-94

    第5章 讨论94-104

    5.1 实验策略学95-96

    5.2 大鼠心肌缺血-再灌注模型的损伤96-98

    5.3 HSYA 抗心肌缺血-再灌注损伤的作用98-99

    5.4 HSYA 抗心肌缺血-再灌注损伤作用的分子机制99-104

    5.4.1 HSYA 通过线粒体途径发挥抗凋亡作用99

    5.4.2 HSYA 抑制钙超载的可能机制99-100

    5.4.3 HSYA 通过激活线粒体 Cx43 保护线粒体而发挥抗缺血-再灌注损伤的作用100-101

    5.4.4 HSYA 抑制心肌缺血再灌注心肌细胞自噬的机制101-104

    结论104-106

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