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摘要：目的以标准真菌菌株、临床分离培养的常见浅部致病真菌菌株及阴性对照菌株中提取DNA并扩增出靶基因序列ITS区，针对此区域设计出特异性寡核苷酸探针为后续试验提供基础。策略将标准真菌菌株、临床分离培养的常见浅部真菌菌株及阴性对照菌株参照Biospin真菌基因组DNA提取试剂盒说明操作提取DNA。采取真菌通用引物ITSl（5’端生物素标记）和ITS4对提取的DNA进行PCR反应得到靶基因序列即ITS区并进行电泳检测。运用Array Designer4软件在真菌ITS1或ITS2区设计特异性寡核苷酸探针，依据长度、Tm值、G+C含量、发夹结构、自身二聚体以及重复碱基数等指标筛选出最好的探针，提交到Genbank进行BLAST特异性浅析后进行合成。结果所提取的真菌基因组DNA的PCR产物经琼脂糖凝胶电泳均能扩增出目的条带，扩增产物大小在500-700bp之间。运用探针设计软件设计出了14个特异性寡核苷酸探针，其中红色毛癣菌和紫色毛癣菌共用特异性探针Trirv，犬小孢子菌和铁锈色小孢子菌共用特异性探针Miccf，断发毛癣菌和许兰氏毛癣菌共用特异性探针Trits；其他菌株均有各自的种特异性探针。结论Biospin真菌基因组DNA提取试剂盒能简便快速的提取真菌DNA；采取通用引物ITSl和ITS4对提取的DNA进行PCR反应能扩增出真菌靶基因序列ITS区，自此区运用Array Designer4软件能设计出待检真菌的特异性寡核苷酸探针。目的为了快速简便、准确直观的鉴定临床常见浅部致病真菌，建立一种采取纳米金基因芯片技术对临床常见浅部致病真菌鉴定的策略。策略将设计出的探针按设计好的顺序排列在醛基化的玻璃片上制备所需的基因芯片。将制备的基因芯片与待检真菌PCR产物杂交，杂交后将纳米金标记的链霉亲和素与芯片温育形成生物素-链酶亲和素-纳米金生物反应放大系统，最后结合银增强染色将检测信号再次放大后直接目测实验结果。结果3’端氨基化修饰的真菌特异性寡核苷酸探针与醛基化的玻璃片反应后牢固的固定于玻片上，制备出了所需的基因芯片。运用所制备的基因芯片对真菌标准菌株、临床分离的常见浅部致病真菌菌株及阴性对照菌株按上面陈述的策略进行了检测。结果显示17株皮肤癣菌和念珠菌的标准菌株对应的特异性探针及阳性对照点可目测到阳性信号，阴性对照及其他探针点无信号,与实际菌株种型相符；2株阴性对照菌株检测结果仅阳性对照点能观察到信号。临床分离的32株皮肤癣菌、33株念珠菌的基因芯片检测结果与临床常规鉴定策略结果一致。结论本实验所制备的纳米金基因芯片能简便快捷、直观准确的鉴定出临床常见的浅部致病真菌。关键词：浅部致病真菌论文靶基因序列论文寡核苷酸探针论文浅部致病真菌论文纳米金基因芯片论文链酶亲和素论文
英文缩写一览表5-6
中文摘要6-9
Abstract9-12
前言12-14
第一部分 真菌靶基因序列的制备和特异性寡核苷酸探针的设计合成14-25
材料和策略14-20
试验结果20-23
讨论23-25
第二部分 纳米基因芯片的制备及运用其鉴定临床常见浅部致病真菌25-35
材料和策略25-29
实验结果29-32
讨论32-35
全文总结35-36