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摘要：近年来，随着免疫力低下人群的增加，侵袭性真菌感染的发病率逐年上升。该病起病隐匿，临床早期无特异性体征，病情进展迅速，死亡率高，已遍布临床各科室，且抗真菌药物少，副作用大，诊断困难。由此，建立快速、特异、灵敏的检测策略，对于早期诊断、及时治疗，降低患者死亡率及改善预后至关重要。目前，侵袭性真菌感染的诊断策略主要为传统培养和组织病理学策略，但有着耗时长、阳性率低、有创伤性等缺点。以核酸为基础的分子生物学诊断策略因具有快速、特异和敏感的优势，在临床早期检测中具有广阔的运用前景。本探讨针对侵袭性真菌感染的主要病原菌，建立了环介导恒温扩增（loop-mediatedisothermal amppfication, LAMP）和纳米金辅助半巢式PCR（semi-nested PCR,snPCR）检测策略。1. LAMP策略用于主要病原真菌的检测LAMP技术是一种简便、准确、廉价的核酸扩增策略，依赖于链置换酶（Bst酶）在恒温水浴锅条件下快速、高效的扩增核酸。该策略检测时间短、操作简单、设备要求低、结果易于观察。近十年来，LAMP技术被广泛运用于病毒、细菌及寄生虫等的诊断，但较少运用于真菌感染的诊断。本探讨以ITS（internal transcribed spacer）为靶基因，分别设计了烟曲霉和检测丝酵母属LAMP引物，建立了鉴定烟曲霉和检测丝酵母属的LAMP策略。对反应温度、Mg2+浓度及Bst酶浓度等进行优化，确定了最佳反应系统。根据LAMP反应产生的特异性梯形条带可快速、特异的鉴定烟曲霉和检测丝酵母属，其他常见病原菌未见扩增，灵敏度达pg级（烟曲霉6.0pg、检测丝酵母属0.g），可在3h-4h内完成，高于常规PCR10倍。该策略灵敏度高、反应快速。另外，利用该策略对烟曲霉和白检测丝酵母感染小鼠的血液、组织标本进行检测，检出率达70%-90%，较培养法高，可实现非培养标本的快速检测。2.纳米金辅助snPCR策略用于检测丝酵母属的检测snPCR具有快速、特异、敏感等优点。本探讨以GAPDH（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase）为靶基因，设计检测丝酵母属特异性引物，建立了snPCR策略，用于鉴定检测丝酵母属。但snPCR受引物、dNTP、模板DNA纯度等影响有时会出现非特异性扩增条带。本探讨在snPCR系统中，加入了纳米金粒子（gold nanoparticles, AuNPs）。实验结果显示，加入4nM AuNPs（粒径13nm）后，仅有约360bp的目的条带产生，且其产量增加，表明AuNPs可消除非特异性条带扩增，增加目的条带产量。且与未加AuNPs的snPCR比较，该反应的灵敏度提升10倍，表明AuNPs可提升反应的扩增效率。利用该策略扩增临床检测丝酵母属常见种，均可产生约360bp的特异性条带，其它临床常见病原菌未见扩增，检测灵敏度达30fg，并可在6h内完成。该策略可特异的鉴定检测丝酵母属，灵敏度高、反应快速。另外，利用该策略检测白检测丝酵母感染小鼠的血液、组织标本，检出率达80%-90%，显著高于培养法。综上所述，本探讨针对烟曲霉和检测丝酵母属，成功建立了LAMP和纳米金辅助snPCR策略。这两种策略可特异性的鉴定烟曲霉和检测丝酵母属，灵敏度高，并均可实现非培养标本的快速检测，较培养法检出率高，检测时间短（可在3-6h内完成），为临床早期和痕量标本DNA的快速检测提供借鉴。关键词：病原真菌论文LAMP论文半巢式PCR论文纳米金论文快速检测论文
中文摘要4-6
Abstract6-11
第1章 绪论11-19
1.1 侵袭性真菌感染近况11-13
1.1.1 侵袭性曲霉感染11-12
1.1.2 侵袭性检测丝酵母感染12-13
1.2 侵袭性真菌感染的诊断13-17
1.2.1 镜检13
1.2.2 培养法13
1.2.3 影像学检查13-14
1.2.4 组织病理学检查14
1.2.5 血清学检测14
1.2.6 核酸扩增技术14-17
1.3 本探讨立题依据及探讨内容17-19
1.3.1 立题依据17-18
1.3.2 探讨内容18-19
第2章 LAMP 策略用于主要病原真菌的检测19-40
2.1 材料与策略19-28
2.1.1 材料19-22
2.1.2 策略22-28
2.2 结果28-38
2.2.1 烟曲霉 LAMP 策略的建立28-31
2.2.2 检测丝酵母属 LAMP 策略的建立31-34
2.2.3 侵袭性真菌感染小鼠标本的检测34-38
2.3 讨论38-40
第3章 纳米金辅助半巢式 PCR 用于检测丝酵母属的检测40-51
3.1 材料与策略40-43
3.1.1 材料40
3.1.2 策略40-43
3.2 结果43-48
3.2.1 纳米金辅助 snPCR 的建立43-46
3.2.2 白检测丝酵母感染小鼠标本的检测46-47
3.2.3 模拟检测丝酵母感染全血标本的检测47-48
3.3 讨论48-51
第4章 结论51-52