摘要：阿尔茨海默病（AD）是一种以记忆和认知功能障碍为主要症状多发于老年群体的神经退行性疾病，发病后较难治愈，AD主要的病理学特点包括脑神经元外出现的β淀粉样蛋白（Aβ）的沉积和其进一步形成的老年斑（SP），细胞内过度磷酸化的Tau蛋白导致的神经纤维缠结和神经元的营养坏死等。很多证据表明Aβ42可溶性的寡聚体的神经毒性最强，很可能是AD发病的关键因素。如何安全而有效地阻止甚至清除Aβ42毒性肽被认为是预防和治疗AD的有效策略。本论文以Aβ42的寡聚体作为AD的靶点，旨在寻找能够抑制Aβ42的寡聚体神经毒性并可以真正通过血脑屏障在体内产生治疗AD效果的天然药物，并尝试对其作用机制进行初步的探讨和探讨。本论文首先总结浅析并筛选了中医用于治疗AD的中药，综合近年来对AD致病机理的探讨，筛选出肉苁蓉、淫羊藿、石菖蒲、茯苓、黄芪、何首乌、红景天、远志、绞股蓝、天麻、当归、苦参、熟地黄、蛇床子、益智仁、女贞子共16味中药材作为具有潜在治疗阿尔茨海默病的天然药物，通过高通量筛选，确定了十种具有抗Aβ42寡聚体神经毒性的提取物，并锁定了10种可能对Aβ42的细胞毒性有抑制作用的化合物，再根据所选化合物与AD治疗相关的文献报道，基于提取物中有效成分的浓度，透过血脑屏障所需的化合物的物理化学性质的考虑，最终确定了两种单体化合物：阿魏酸（样品A）和苦参碱（样品B）作为潜在具有抗Aβ42细胞毒性的目标化合物，在体外通过构建具有神经细胞特性的SH-SY5Y细胞的AD细胞模型，进一步在细胞水平上和分子水平上检测这两种单体化合物对Aβ42聚集的影响和变化，同时在分子水平上对这两种单体化合物抑制Aβ42毒性的作用机理进行初步的探讨。本论文在体外检测了样品A和B对Aβ42诱导的细胞毒性的抑制作用，结果显示：以SH-SY5Y细胞为靶细胞，样品A体现出抑制Aβ42单体及寡聚体诱导的细胞毒性的作用；PC12细胞和SH-SY5Y细胞为靶细胞，样品B均体现出抑制Aβ42单体及寡聚体诱导的细胞毒性的作用，结果表明样品A和B均具有抗Aβ42的神经保护作用。进一步通过CD色谱的手段探讨样品A与Aβ42的相互作用我们发现样品A可以抑制Aβ42单体中β折叠结构的形成，但当Aβ42形成寡聚体后，样品A却反而推动了Aβ42寡聚体中β折叠结构的形成，而样品B则均可抑制Aβ42单体和寡聚体聚集形成β折叠。随后通过透射电镜的观察样品A和B对Aβ42聚集形态的影响结果和Th-T荧光染色检测样品A和B对Aβ42聚集程度的影响的结果均与CD色谱结果相符合，证实了样品A可以抑制Aβ42单体的聚集，但是却可以推动Aβ42寡聚体的聚集的特性。而样品B则可以抑制Aβ42单体和寡聚体的聚集。接下来通过样品A和B对Aβ42不同聚集状态的特异性探讨我们发现样品A和样品B对Aβ42单体，寡聚体和纤维三种聚集状态均有特异性，样品A对Aβ42寡聚体的特异性最低，而样品B对Aβ42单体的特异性最低。由于AD的病灶在脑内，所以药物是否可以有效的通过血脑屏障发挥作用是我们所必须优先考虑的重要因素。由此在接下来的实验我们检测了样品A和B对SH-SH5Y细胞膜的透过效率，结果显示样品A对SH-SH5Y细胞的细胞膜具有一定的透过性。而在对样品B进行小鼠灌胃后的初步探讨中我们在灌胃小鼠的脑匀浆提取物中检测到了样品B的有着，确定了样品B可以通过血脑屏障而进入脑内；而通过MTT实验我们在体外证实了在体内代谢后的样品B仍然可以对Aβ42寡聚体诱导的细胞毒性产生抑制作用。通过浅析样品A和样品B对Aβ42的二级结构变化，聚集形态变化和特异性等多方面的影响后我们最终确定了样品A和样品B对Aβ42是有相互作用的，而且通过这种相互作用样品A和样品B可以转变Aβ42的聚集状态，最终抑制Aβ42的诱导的神经毒性，那这种相互作用的分子机制是什么？我们运用分子对接的策略对样品A和B与Aβ42单体的相互作用进行了模拟，分子对接的结果显示样品A和样品B分别都能够与Aβ42单体产生相互作用，作用位点相似，而作用机制不同，样品A主要通过氢键与Aβ42相互作用，而样品B则依靠静电相互作用与Aβ42相结合。综上所述，本论文通过对筛选后得到的两种天然单体化合物阿魏酸（样品A）和苦参碱（样品B）与AD的靶点Aβ42寡聚体的相互作用的探讨，确定了样品A和样品B均可以通过抑制或推动Aβ42的聚集使其远离最具神经毒性的Aβ42寡聚体结构形式，起到抑制Aβ42的神经毒性，保护神经细胞的作用；此外我们还发现，样品A可以抑制Aβ42单体的聚集，但却推动Aβ42寡聚体的聚集，而动物实验证实了样品B可以通过血脑屏障进入脑内并在体内代谢后仍然可以对Aβ42寡聚体诱导的细胞毒性产生抑制作用。初步的分子对接模拟结果也展示了样品A和B针对Aβ42单体不同的作用机制和相似的作用位点，这些实验结果都为进一步的研发治疗AD的药物提供了新的实验依据和参考。关键词：阿尔茨海默病论文β-淀粉样蛋白论文天然化合物论文
摘要5-8
Abstract8-15
第一章 绪论15-33
1.1 Aβ的代谢15-16
1.2 AD 的免疫疗法16-22
1.2.1 前期动物实验及 AN1792 临床试验17-18
1.2.2 Aβ42 抗原表位18-19
1.2.3 Aβ聚集体的构象变化及其神经毒性19-20
1.2.4 新型 AD 疫苗的探讨20-22
1.3 AD 的药物治疗22-25
1.3.1 针对 Aβ42 靶点的药物开发23
1.3.2 AD 药物的研发与血脑屏障23-25
1.4 Aβ42 聚集体的分子结构25-27
1.5 传统中药对阿尔茨海默病的治疗27-33
第二章 筛选治疗和预防阿尔茨海默病的天然药物的探讨33-47
引言33-34
2.1 实验材料与策略34-39
2.1.1 实验材料与仪器34-35
2.1.2 实验策略35-39
2.2 实验结果39-45
2.2.1 天然药物的筛选及其天然药物提取物的获得39-40
2.2.2 具有抑制 Aβ42 诱导的细胞毒性的天然药物粗提物的筛选40-45
2.3 本章小结45-47
第三章 针对 Aβ42 寡聚体靶点的单体化合物的效应浅析47-75
引言47-48
3.1 实验材料与策略48-54
3.1.1 实验材料与仪器48
3.1.2 实验策略48-54
3.2 实验结果54-74
3.2.1 样品 A 和 B 对 Aβ42 寡聚体诱导细胞毒性的抑制和中和作用54-59
3.2.2 样品 A 和 B 对 Aβ42 聚集历程中二级结构的影响59-63
3.2.3 透射电镜观察样品 A 和 B 对 Aβ42 聚集形态的影响63-65
3.2.4 样品 A 和 B 对 SH-SY5Y 细胞的细胞膜透过效率的探讨65-66
3.2.5 样品 A 和 B 对 Aβ42 各种聚集状态的特异性探讨66-68
3.2.6 Th-T 法检测样品 A 和 B 对 Aβ42 聚集状态的影响68-69
3.2.7 小鼠灌胃样品 B 后血清和脑内的样品 B 含量测定69-70
3.2.8 给药血清和脑匀浆提取物对 Aβ42 寡聚体细胞毒性的抑制作用70-71
3.2.9 样品 A、B 和(Aβ9)16 系列诱导抗体针对 Aβ42 靶点的效应比较71-74
3.3 本章小结74-75
第四章 单体化合物与 Aβ42 的分子对接探讨75-81
引言75
4.1 实验策略75-76
4.1.1 模型的构建和动力学优化75
4.1.2 分子对接和打分函数75-76
4.2 实验结果76-80
4.2.1 样品 A 和样品 B 的 3D 结构76
4.2.2 样品 A 与 Aβ42 的分子对接76-78
4.2.3 样品 B 与 Aβ42 模型的分子对接78-80
4.3 本章小结80-81
全文结论81-83
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