摘要：反应性神经胶质细胞增生,也称为胶质瘢痕形成，是中枢神经系统（CNS）对损伤刺激作出的一种特殊细胞反应，主要由星形胶质细胞、小胶质细胞、纤维母细胞、内皮细胞、以循环系统侵入的免疫细胞以及细胞外基质成分（ECM）包围在损伤区域构成。炎症反应是脊髓继发性损伤的重要组成部分，也是胶质瘢痕形成的启动因素之一。胶质瘢痕形成的一种特殊的物理屏障和分子屏障分隔损伤区域和周围健康脊髓组织，胶质瘢痕一方面可以减轻脊髓损伤后炎症细胞对周围健康脊髓组织的进一步破坏，另一方面也构成了脊髓损伤修复历程中轴突再生延伸的主要障碍。尽管星形胶质细胞激活是脊髓损伤中的一个重要病理变化，也是脊髓损伤治疗的重要“靶点”，但是，目前我们对于星形胶质细胞激活历程的信号分子机制我们仍知之甚少。血小板活化因子（PAF）是一种内源性的具有广泛生物活性的磷脂类介质，具有生理和病理双重性作用。PAF的来源广泛，机体内许多细胞都可以合成PAF，在各种病理生理因素的刺激下，PAF通过与靶细胞上的PAFR结合，起到在细胞间传递信号的作用。实验表明，在脊髓损伤的情况下，脊髓组织内PAF的表达水平显著升高，PAF刺激更多的促炎因子合成，加剧组织局部炎症反应而导致更严重的病理结果。同时，运用PAF拮抗剂则可以抑制促炎因子的表达而减轻PAF导致的组织损害效应。最新的探讨证实，在局部脑缺血动物模型中，PAF刺激星形胶质细胞内GFAP表达上调而加重神经胶质细胞增生，而运用PAF拮抗剂则可抑制此种变化。考虑到以上探讨背景，本项目通过建立PAFR基因敲除（PAFR-ko）小鼠和野生型（W_t）小鼠脊髓损伤模型，采取免疫荧光染色、轴突示踪技术、Westernblot、Rotarod test等实验手段，分别在形态变化、蛋白表达和神经功能恢复几个方面观察PAF对星形胶质细胞激活，瘢痕形成，神经功能恢复方面的影响，明确PAF对脊髓神经胶质细胞激活的作用效果，以而对脊髓损伤后神经胶质细胞增生和胶质瘢痕形成的分子机制作出重要探讨，进一步为脊髓损伤的治疗提供新的论述基础和治疗途径，具有重要的论述和实践价值。策略：分别对6-7周龄PAFR-ko小鼠和Wt小鼠建立脊髓背侧半切损伤模型，利用LISA装置执行颈段脊髓（C5-6）背侧半切损伤，切割深度0.70mm，切割宽度1.25mm。分别收集脊髓损伤区域的新鲜和冰冻脊髓标本，运用蛋白定量浅析和免疫荧光染色的策略，在形态学和蛋白水平上，分别在伤后不同的观察点（伤后3、7、14、21、28、42天）观察PAF信号对脊髓损伤不同时期小胶质细胞和星形胶质细胞激活的影响，对损伤后胶质瘢痕形成的影响。分别对6-7周龄PAFR-ko小鼠和Wt小鼠执行颈段脊髓（C5-6）背侧半切损伤，建立脊髓背侧半切损伤模型，采取Rotarod test的评价策略，分别在伤后不同的观察点（伤后3、7、14、21、28、35、42天）对脊髓损伤后小鼠进行神经功能评价，以观察PAF信号对小鼠脊髓损伤后运动功能恢复的影响。结果：脊髓损伤后，损伤局部可见大量小胶质细胞激活，伤后7天为高峰，随后逐渐下降。和Wt组相比，PAFR-ko组脊髓组织局部见更多数量的小胶质细胞聚集和激活；同时，Western blot结果显示，PAFR-ko组脊髓组织内细胞因子IL-6水平在损伤急性期(7dpi)显著下调，和Wt组相比，差别具有显著的统计学作用（p0.05）；至损伤慢性期(42dpi)，两组标本的IL-6的表达水平均显著下降，已无显著性差别（p0.05）。脊髓损伤后，损伤局部星形胶质细胞持续激活，GFAP呈高表达状态，细胞外基质（ECM）合成增加。在损伤急性期（7dpi），PAFR-ko组GFAP表达受到显著抑制，和Wt损伤组相比，差别具有显著的统计学作用（p0.05）。至损伤慢性期（42dpi），PAFR-ko组GFAP表达水平显著下降，与对照组相比，已无显著差别（p0.05）；而Wt组GFAP表达仍呈持续高表达状态，差别具有显著的统计学作用（p0.05）。和Wt组相比，PAFR-ko组在损伤后相同时间点上的CS56免疫阳性表达显著减弱，差别具有显著的统计学作用（p0.05）。两组动物的脊髓损伤后Rotarod test评分结果显示：脊髓损伤后，两组动物的评分值均下降到“0”水平，并呈现随时间逐步提升的走势；以14dpi开始，和Wt组相比，PAFR-ko组评分显著提升，至42dpi，PAFR-ko组评分值仍显著高于Wt组评分，差别具有显著的统计学作用（p0.05）。结论:在中枢神经系统内，PAF通过与其受体结合，参与到脊髓损伤后小胶质细胞和星形胶质细胞的激活历程。而阻断PAF信号可以抑制小胶质细胞和星形胶质细胞的激活，减轻脊髓损伤后炎症反应和胶质瘢痕形成并推动神经功能恢复。关键词：脊髓损伤论文PAF论文小胶质细胞论文星形胶质细胞论文神经功能评价论文
中文摘要4-7
Abstract7-14
第1章 绪论14-32
1.1 CNS 中小胶质细胞和星形胶质细胞的起源、发育、生理功能15-18
1.1.1 小胶质细胞15-16
1.1.2 星形胶质细胞16-18
1.2 CNS 损伤后反应性神经胶质细胞增生--以炎症到瘢痕18-23
1.2.1 小胶质细胞激活与炎症反应18-22
1.2.2 星形胶质细胞激活与胶质瘢痕形成22-23
1.3 小胶质细胞调节 CNS 星形胶质增生23-24
1.4 星形胶质细胞调节小胶质细胞的激活24-26
1.5 血小板激活因子与 CNS26-28
1.5.1 血小板激活因子26-27
1.5.2 PAF 与 CNS 损伤27-28
1.6 总结与展望28-32
第2章 实验探讨32-56
2.1 探讨目的32
2.2 探讨内容32-33
2.3 材料和策略33-43
2.3.1 主要材料33-36
2.3.2 主要探讨策略36-43
2.4 统计策略43
2.5 实验结果43-51
2.5.1 PAFR-ko 小鼠和 Wt 小鼠发育历程中体重变化历程比较43-44
2.5.2 PAFR-ko 小鼠和 Wt 小鼠小胶质细胞和星形胶质细胞发育的比较44-45
2.5.3 P AFR-ko 小鼠和 Wt 小鼠运动功能的比较45-46
2.5.4 脊髓损伤后，PAFR-ko 小鼠和 Wt 小鼠脊髓组织内小胶质细胞激活情况的比较46-48
2.5.5 脊髓损伤后 PAFR-ko 小鼠和 Wt 小鼠脊髓组织内星形胶质细胞激活和细胞外基质重塑情况的比较48-50
2.5.6 脊髓损伤后 Wt 组和 PAFR-ko 小鼠神经功能恢复情况的比较50-51
2.6 讨论51-54
2.6.1 PAF 信号参与脊髓损伤后小胶质细胞的激活51-53
2.6.2 PAF 信号参与脊髓损伤后星形胶质细胞的激活53-54
2.7 结论54-56
本论文的特点与革新之处56-58
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